Fluidigm助力单细胞组学研究

单细胞研究渐成关注焦点
    近两年，基于细胞组学，特别是单细胞组学研究的精准医疗领域越来越受到政府和科学家们的重视。今年3月8日，科技部下发了国家重点研发计划2016年度项目申报指南的通知，其中“精准医学研究”作为其中之一被列入优先启动的重点专项，项目提出：要通过对单细胞组学技术的研发，建立单细胞的高通量快速分离、捕获、提取及测序技术；从而深入推进单细胞技术在重大及罕见疾病临床研究和治疗中的应用；并通过人群队列研究等手段，整合获取的精准医学大数据，建立合理规范的管理、保存、共享机制；进而实现和完善疾病防治方案的个性化、精准化研究。
    值得一提的是，指南中明确指出：作为上述研究的目标和基础，建成“单细胞捕获富集技术”、“单个细胞基因组的均匀、无偏、精准扩增和高通量测序技术”和“整合的单细胞多组学高通量测序技术”等将作为项目的考核指标。因此，未来五年将受到国家重点扶持。
今年2月，北京大学汤富酬、黄岩谊与首都医科大学彭吉润课题组间合作，在单细胞多组学测序领域实现重大突破，在世界范围内首次实现了单细胞水平的基因组、转录组、表观基因组的三重组学测序。利用这一新技术，研究人员对源自一个肝癌病人的25个单细胞的CNVs、DNA甲基化组和转录组进行了检测分析，成功鉴别出了这些细胞内的两个亚群，从而为肿瘤的个性化精准治疗提供了大量数据基础。
    国际上，科学家们也将目光越来越多地“聚焦”于单细胞研究领域。就在科技部公布“精准医学研究”作为未来五年国家重点研发计划之际，为期3天的单细胞生物学大会于3月9日到11日在英国召开：来自世界各国的科学家就包括肿瘤、免疫、干细胞、精准治疗等多个热点研究领域进行了广泛交流。一方面，通过检测细胞异质性、基因组学和精准表征等手段，深入了解细胞基因、表观、功能的变化，重大疾病如急性白血病（AML、ALL）的病理机理，肿瘤个性化治疗中特异性靶点的筛选等议题受到了参会人员的关注；另一方面，如何在单细胞水平实现快速的高通量样本捕获制备，提高单细胞测序、基因表达、分型等研究方法的数据量，从而进一步确保实验数据的有效性和准确性，并进行大规模数据统计分析，推进单细胞技术在临床研究和治疗中的应用也成为大家讨论的另一焦点话题。
    在此次单细胞生物学大会上，科学家们通过讲座、海报等形式展示了各自的实验成果，其中不少研究项目中提出借助Fluidigm公司的自动化单细胞制备平台，可以快速、稳定实现单细胞的高通量分离、捕获、制备、预扩增，大大提高了实验数据量和效率，缩短了实验时间（见 表一）。
表一：采用Fluidigm产品进行研究的汇报项目。
 
高通量捕获单细胞及样本制备分析
    随着二代测序技术的日趋成熟和相关仪器的快速发展，单细胞测序已经逐渐成为广泛使用的实验手段之一，但其上游实验流程——高通量样本制备一直是限制单细胞研究发展的一大瓶颈。
    针对单细胞研究中难于快速捕获大量单细胞，制备过程复杂繁琐、变量多，低样本量难以满足后续检测等难题，Fluidigm公司基于专利微流体技术开发了一种全新的单细胞基因表达检测方法。通过C1TM单细胞自动制备系统，将仪器、微流控芯片、试剂、软件等进行整合，首先可以自动完成单细胞的捕获、裂解、逆转录和预扩增，实现 “加样走人”的自动化实验流程；其次利用该系统只需要30分钟的手工操作时间，就可以在十几个小时内快速完成从几十个到多达800个单细胞样本的捕获和制备；最后收集的预扩增产物可与后续包括Illumina、ABI等市场常规测序平台无缝连接。
 
    此外， C1还可以与BioMark HD 系统有机结合实现单细胞基因检测，后者作为一个多功能平台，可以进 行基因表达谱分析、分型检测、实时定量（数字）PCR以及单细胞分析，在4小时内完成多达96 个单细胞 x 96个位点的分析，而所需操作时间只有15分钟。
 
    作为硅谷一家专门致力于单细胞研究技术开发的公司，Fluidigm（富鲁达） 不断优化完善从系统、芯片、试剂到软件的每个环节，目前已具备针对单细胞研究的多种仪器平台和十余种相关的微流控芯片，满足不同类型的实验需求。
创新技术开拓更广泛的单细胞研究空间
1、Polaris——单细胞定向捕获、处理与检测的一体化技术平台
    最近，Fluidigm公司在C1的基础上，又推出了Polaris平台。“这是一个集细胞培养、处理、观察和测序于一身的技术平台。我们可以通过它分选捕获特定的单细胞，在对这些单细胞分别进行培养刺激后，进一步回收样本进行测序”，牛津大学的Quin Wills在他的会议报告中说。这一技术令Wills博士和他的同事感到非常激动，“我们可以精确控制细胞微环境，并对处于该环境中的单细胞进行观察和测序分析，了解哪些是涉及细胞与环境、细胞与细胞间相互作用的关键基因……这对识别不同的基因簇，发现罕见的基因表型非常重要！”
2、IMC——直接利用组织切片进行的质谱流式分析技术
    在很多重大疾病如肿瘤中，环境因素对细胞的影响至关重要。肿瘤细胞的异质性和复杂的微环境因素一直是干扰临床有效治疗的问题之一。即使是同一种肿瘤，不同的患者间又千差万别，因此想要进行有效的个体化精准治疗，首先需要对患者的样本有充分细致的分析检测。
    质谱流式技术（mass cytometry，CyTOF）利用金属标记物代替传统的荧光标记，解决了长期以来流式技术中最大的瓶颈——荧光相关重叠干扰的问题，无需进行荧光补偿，可对一个单细胞样本进行一百多种的抗体标记。特别是新一代的Helios质谱流式仪（IMC — imaging mass cytometry技术），利用病人的组织样本（冰冻/石蜡切片、贴壁细胞）进行抗体标记，无需细胞消化可直接上机检测。利用这一方法，苏黎世大学的Bernd教授对几百位乳腺癌病人的组织切片进行了分析。他采用44个特异性抗体同时标记样本，检测后对获得的大量数据进行了精确分析鉴定。结果令人惊讶，无论是在同一病人的样本内部，还是不同病人的同种肿瘤样本间，都显示出了高度的细胞、组织异质性。根据标记物的表达差异，Bernd教授进一步将乳腺癌细胞分为不同的亚群，并找到每个亚群的特异性标记物。
    此外，这种直接利用病理切片的流式检测方法，还可同时进行多维数据分析，以寻找不同亚群的分布和异质性对肿瘤微环境产生的影响。质谱流式技术无疑为临床治疗提供了可靠的数据，并为个体化精准医疗方案的制定提供了指导方向。
 
（责任编辑：wzx）