丙肝病毒PCR检测操作规程

1． 样品处理：① 取50UL被检血清/血浆，加入试剂A200ul，试剂B50ul，用混匀器充分混匀到无颗粒状态。② 14000rpm离心5分钟。③ 取出上清80-100ul，加入等体积试剂C，混匀，14000rpm离心10分钟。④ 轻轻将液体全部倒掉，在滤纸上沾干残留部分。⑤ 加入200-400ul 75%预冷酒精，颠倒混匀，14000rpm离心5分钟。⑥ 轻轻倒掉液体，在滤纸上沾干残留部分，最后65℃烘箱烘干或94℃快速烘干备用。2． 反转录及PCR扩增① 反转录取         PCR Mix Ⅰ    28ul/人份×人份数加入       RT-Enzyme Mix  2ul/人份×人份数混匀后，取30ul分别加于每个已制备好的样品管中（每人份用一个枪头）滴加两滴液体石蜡，离心数秒，37℃保温30分钟，进行反转录反应。② 第一次PCR循环：反转录结束后直接按下列参数进行PCR循环。预变性  94℃         300秒                94℃       300秒                   94 ℃         45秒                94℃       30秒                     50℃         45秒                50℃       30秒                    72℃         45秒 共30Cycles     72℃        30秒 共30 Cycles         终延伸   72℃          300秒              72 ℃          300秒                   水浴式扩增仪                     单槽式扩增仪                 ③ 第二次PCR循环取         PCR Mix Ⅱ    22.5ul/人份×人份数加入       Taq DNA聚合酶  0.5ul/人份×人份数混匀后，取23ul分别加于每个离心管中滴加两滴液体石蜡,再取第一次循环后的产物2ul,分别加于各管中,离心数秒,按下列参数进行第二次扩增.预变性  94℃         300秒             94 ℃         300秒                   94 ℃         45秒             94℃          30秒                     55℃         45秒             55 ℃         30秒                     72℃         45秒 共30Cycles  72℃          30秒 共30 Cycles         终延伸   72℃          300秒           72℃           300秒                   水浴式扩增仪                   单槽式扩增仪      结果判断① 将50×TAE电泳缓冲液20ml加双蒸水稀释至1000ml（1×TAE）待用，取50 ml 1×TAE缓冲液于三角瓶中，加入一支琼脂糖（加入少许双蒸水，以防止加热过程中水分蒸发而改变琼脂糖胶的浓度），加热使之溶解至清亮状。待琼脂糖凉至50℃左右时，倒入事先准备好的电泳平板上。② 取15ul第二次扩增产物加样于制备好的琼脂糖凝胶上，在1×TAE缓冲液中80-100V电泳15-20分钟，紫外灯下观察结果。在302nm紫外灯下被溴化乙锭染色的DNA呈红橙色荧光。样品出现和阳性对照在同一水平位置上的红橙色荧光带即为阳性，否则为阴性。
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