采用通过监测产物积累进行的实时反转录聚合酶链式反应（ RT － PCR ）可以用来验证基因表达的差异。我们在此报道了一种基于 SYBR Green I 染料进行的实时 PCR 定量方法并通过产物的融解曲线来确定在基因表达谱方法中确定的基因表达差异的重复性。因为 SYBR Green I 染料是一种非特异性的结合染料，所以反应使用了”热启动” PCR 以及通过经验性数据来确定退火以及检测产物的温度。相对的基因表达水平可以通过使用一系列的 cDNA 浓度做出标准曲线来进行定量。使用这种方法，实时 PCR 可以确定 DNA 阵列 71% （ 17 ／ 21 ）的准确性，和 91% （ 1 ／ 31 ）的差异显示的准确性。验证 DNA 阵列的基因表达差异与杂交信号的强弱有关。实时 RT － PCR 结果表明 DNA 表达差异在 2 － 4 倍间的差异无法判断其正确错误与否。而差异显示 PCR 的结果验证不依赖于信号的强度。无论是何种基因表达谱技术（微阵列， DDPCR ，基因表达系列分析技术还是差异杂交技术），如果已经知道目的基因的序列，那么实时 RT － PCR 方法就可以适用于验证这些差异表达，因为它具有定量功能而且需要的 RNA 量比传统方法要低 1000 倍。
DNA 阵列（微阵列）和差异 RT － PCR 方法是两种可靠的确证基因表达和基因组广泛转录本差异的方法。这些技术确定样本表达差异的重复性和敏感性的可靠性受到几个因素的影响。微阵列的实验结果受到阵列产物、 RNA 提取、探针标记、杂交温度条件和图像分析（ 1 － 4 ）的影响。 DD － PCR 结果受到电泳分辨率、弱和差异引物、条带确证和结合部分的影响。因为这些可靠性上的限制，被确定为差异表达的基因要经过另一种方法的检测。 Northern 杂交或者 RNA 酶保护分析都是有效的但是至少要 5mg 的 RNA 。传统的逆转录聚合酶链式反应（ RT － DDPCR ）要求的 RNA 要少一些，但其终点分析缺乏定量上的精确性（ 6 － 8 ）。实时 RT － PCR 技术方法是当前最新的确定基因表达的方法，在这篇报道中，我们详细描述了使用实时 PCR 技术和其与 DNA 阵列以及 DD － PCR 技术的相互结合，来验证基因表达的正确性。
方法描述 :
基本策略
为了满足验证表达谱研究确定的大量基因，我们研究了实时定量 PCR 系统并使用 SYBR Green I 染料。此外，还用每个基因的一系列已知浓度的模板制作了绝对定量曲线，以相对比较不同的样本。相对定量曲线只需要使用在表达谱研究中确定的一个高表达样本中获得的 cDNA 的一系列稀释度制作完成。
尽管仍然需要设计基因特异性的引物，但不需要设计内在的基因特异性的荧光探针。此外，反应的特异性由产物的 Tm 值确定（ Tm ： DNA 双螺旋一半解链时的温度）。反应的特异性由”热启动” PCR 得到提高，并在低于产物 Tm 值 1 － 2 ℃时获得信息。这样就可以避免由通常来说 Tm 值较低的引物二聚体引起的非特异性信号（ 10 ）。
实时 PCR的反应条件
逆转录反应条件
使用在基因表达谱分析中采用的总 RNA 进行验证实验。采用 SuperScript First Strand Synthesis System 进行 RT-PCR （ Invitrogen, Carlsbad, CA) ）反应来合成 cDNA ，反应体系为 20ul ，里面包含 1 m gDNaseI 处理过的总 RNA ， 20 mM Tris–HCl (pH 8.4) ， 50mMKCl ， 2.5mMMgCl2 ， 10mMdithiothreitol (DTT) ， 0.5 m g oligo(dT)12–18, dNTP （各 0.5mM dATP, dGTP, dCTP, 和 dTTP ） 以及 200 U SuperScript II Reverse Transcriptase 。混合组分时，先混合 RNA 和 oligo(dT) ， 70 ℃保温 10 分钟，再放到冰上并加入剩余的反应组分。反应在 42 ℃孵育 1 小时，然后再 70 ℃加热 15 分钟终止反应。 cDNA 再加入 2 U 的 RNase H (Invitrogen) 37 ℃孵育 20 分钟，再在 70 ℃加热 15 分钟终止反应。此外用一个没有逆转录酶的反应来验证是否有基因组 DNA 的污染（无 RT 对照）。 cDNA 在使用前放置在－ 20 ℃保存。进行实时定量 PCR 前不需要进行 cDNA 的纯化。
确定实时定量 PCR 的反应条件
使用 GENSET OLIGOS, Oligo Version 4, (GENSET Corp., La Jolla, CA) 或者 LASERGENE 的 PRIMERSELECT 软件 (DNASTAR, Inc., Madison, WI) 计算产物的 Tm 值来确定反应的退火温度。摸索退火温度时，每次以计算得到的 Tm 值增加或减少 2 － 3 ℃，直到其与引物二聚体和非特异性产物间有 3 － 5 ℃的差别。信息采集时候的温度可以设置到特异性产物的 Tm 值以下 1 － 2 ℃，以减少非特异性产物的干扰。
反应步骤和循环条件
所有的步骤按照仪器的使用说明进行。按照试剂说明将包含有 Tag DNA 聚合酶， dNTP, MgCl2, 和 SYBR Green I 染料的 DNA Master SYBR Green I 混合液与 0.16 m l TaqStart Antibody (Clontech,Palo Alto, CA) 混合一起室温孵育 5 分钟，然后再加入引物和 cDNA 模板。除此外，每个反应（ 20ul ）中包含 2ul 的 cDNA ， 0.4 m M 的引物和 4 m MMgCl2 。使用 1:200 和 1:2000 稀释的 cDNA ，但分析极微量的信息时要求更少的 cDNA 稀释度。每个稀释度进行一个重复实验，同时用一个无模板的阴性对照，这些优化实验不用于标准曲线。反应条件包括 95 ℃先孵育 60 秒预变性和热启动，然后再进行 50 个循环，过程按优化好的实验结果进行。并最终通过仪器进行一个融解曲线分析。
验证实验
实验条件
通过实验确定退火温度和信号读取温度后，就可以设置样品的相对基因表达反应了。 PCR 的反应条件按上述进行。相对定量曲线用两个重复的预测具有最高表达水平的样品的一系列 cDNA 的稀释度（ 1 ： 200,1 ： 2000 和 1 ： 20000 ）进行。并人为地将其数值定为 0.5 、 0.05 和 0.005 。未知模板的的 cDNA 稀释 200 倍。每个基因都做一个无模板的对照，非 RT-PCR 对照只用一对引物来确定是否有基因组 DNA 的污染。引物为 G3PDH 的引物，并同所有的稀释为 1 ： 200 的无 RT 模板进行比较。
反应温度也同上进行热启动过程并按照反应条件进行，同时也做融解曲线分析。为了使结果可信，至少三个定量稀释度中的二个必须特异性的反应（以 Tm 值为交准），而无模板对照在比信号读取温度低的时候必须没有产物和引物二聚体。如果只有一个稀释度产生了特异性产物，那么则需要重新调整稀释度来保证至少标准曲线上有两个可应用的点，如果引物二聚体影响了读板温度，就应该调整反应温度。如果无 RT 对照通过融解曲线分析发现有产物存在，则应用 DNA 酶 I 来消除 DNA 污染。
计算
每组反应都用随机的软件进行分析，并按照软件的操作手册进行。简单地来说，就要设定好域值线消除掉无信息的荧光背景信号，标准曲线由仪器自动按照设定好的值生成。软件能为每个反应自动计算最终的浓度。并最终得到样本的浓度和相关系数。
使用实时 PCR技术验证基因表达:
当待检基因序列已知时可以用上述描述的定量 RT － PCR 的方法来验证不同基因表达方法（ cDNA 阵列， DD － PCR ，基因表达系列分析以及杂交）得到的结果。这里描述的是用实时定量 PCR 技术来检测与微阵列与 DD － PCR 方法得到的结果。详细的步骤在图 1 中进行了描述。
验证 DNA阵列结果
可用以上述描述的方法来验证任何阵列平台（ cDNA 或寡核苷酸）得到的基因表达差异。例如，我们使用采用基于 cDNA 的高密度阵列（ Atlas Human Cancer cDNA Expression Array; Clon-tech ）来研究 W12 脑上皮细胞的两个亚克隆 (20863 和 20861) 采用 HPV16 处理不同状态时的基因表达差异（ 9 ）。用于验证的基因基于其杂交的荧光强度（亚克隆 20863 作为参考）和相对荧光强度（亚克隆 20863 与亚克隆 20861 ）。
基因特异性引物来验证阵列结果
对于 Clontech 阵列来说，可以从制造商处获得基因特异性引物的信息。在本例中，需要的只是合成引物。如果没有此信息，可以设计基因特异性的引物（使用从 GenBank 中得到的序列信息）以用于验证结果。引物应当为 17–24 个碱基长，产物大小为 150–650bp 。产物太大的话不适用用于定量扩增。避免基因家族的保守性区域可以得到更好的特异性结果。
实时 RT-PCR 与 DNA 阵列结果的比较
G3PDH 是在大多数细胞中表达的含量丰富的看家基因，但在某些条件下的表达发生改变（ 11 ），通过 DNA 阵列杂交发现， G3PDH 的转录本在亚克隆 20863 和 20861 中的表达相同。实时定量 RT-PCR 也发现在两个亚克隆中有着相同的转录水平 (9) ，实时 PCR 的忠实性可以由无 RT 和加水的对照以及每个基因的 CV 值得到证明。每个高强度杂交的基因平均的 CV 值为 12%( 范围： 1-25%) ，而对于低杂交强度的基因来说则为 18%( 范围： 18-28%) 。
表 1 计算相对表达水平以及变异系数
组 1
0.447
0.0285
0.559
0.0226
平均值
0.503
0.0255
组内 CV
15.7%
16.32%
组 2
0.556
0.0203
0.45
0.0298
平均值
0.503
0.0250
组内 CV
14.9%
26.8%
组平均值
0.503
0.025
组间 CV
15.32%
21.57%
相对表达水平（样品 1 ／样品 2 ）＝ 0.503 ／ 0.525 ＝ 20 倍
变异系数＝标准偏差／平均值＊ 100
变异系数的值由 RT － PCR 的结果决定
. cDNA 和实时 PCR 得到的基因表达结果的变化在表 2 中， 实时 PCR 的结果表明了当杂交信号较高时大多数的 cDNA 差异结果 (88% ， 15 ／ 17) 或者是在不同亚克隆间表达水平的差异可以达到 4 倍的基因得到了确定 (5 ／ 5) 。而在低强度杂交的样本中只有一个得到了确定 (1 ／ 4) 。总的来说，实时定量 PCR 确定了 81%(17 ／ 24) 的基因。 cDNA 阵列和实时 PCR 得到基因表达量上的差异也有差别。例如，在 14 个由实时 PCR 验证的基因中，有 10 个表达的差异水平要超过由 cDNA 阵列确定的表达水平。
验证 DD-PCR结果
DD-PCR 条带的选择和基因特异性引物
DNA 阵列和 DD-PCR 技术间主要的差别在于 DD-PCR 条带上并没有序列信息。因此，验证的第一步就是要从 DD-PCR 结果胶中切下目的条带并从中回收 DNA 。切下选择的条带按照荧光 DD-PCR 手册 (Beckman and Coulter, Inc., Foster City,CA) 进行， PCR 得到的反应结果按照 DD-PCR 的条件进行重新扩增，经凝胶回收后再进行测序。将测序结果中未知序列小于 10% 的条带用于验证反应。包含有混合序列的条带不适用于用于验证反应，除非能确定主要序列。确定好序列后，就需要设计引物来进行上述的反应。
实时 PCR 和 DD-PCR 结果的比较 s
在本例中，使用优化的荧光 DD-PCR 系统 (Beckman Coulter, Inc.) 来验证未分化的单层细胞与亚克隆 20861 基因表达的差异。按照荧光强度的不同，将条带相对的表达水平分为 2-4 倍， 5-10 倍和大于 10 倍。根据绝对的荧光值将条带分为弱、中等和强三类。（表 3 ）。
条带 I 设计的引物得到的 . 扩增结果在所有的 cDNA 稀释度中均有重叠。这表明了条带 I 在单层细胞与亚克隆中有着相同的表达， DD － PCR 和实时 PCR 得到的结果有一致的。不同稀释度得到的融解曲线（结果未显示）表明设计的引物均得到了特异性的结果，实时 PCR 用来验证了全部的 13 条差异片段。弱及中等强度信号条带的 CV 值为 10.4% （ 3 － 28.5 ）。而对于强信号的条带来说则为 18% （范围： 0.8% ）。实时 PCR 验证了除了一个外，全部的（ 1 ／ 13,92% ）的 DD － PCR 结果代表了一个已知基因或 EST 。而且不同信号强度的代表了不同相对表达水平。
技术细节 :
RNA 质量是所有基因表达分析中最重要的变数。商业化的 RNA 提取试剂盒可以得到极好的纯度和无降解的 RNA ，这可以适用于酶的反应以及基因表达分析的检测系统。 RNA 的完整性应当在长时间的保存过程中得到保证，因为基因表达谱分析有时候只能在 RNA 提取的数周或数月后才能进行。总 RNA 应该用 DNase I (0.4 u/ m g RNA) 按照试剂盒的要求进行处理。 RNA 用 UV 分光光度计进行定量，并用甲醛的琼脂糖电流来检测降解程度（ 12 ）。
2 ．如果 RNA 的量有限 (10 m g) ，有另一种方法可以替代 DNase I 处理（ 13 ）。方法是在 RT 反应中加入逆转录酶之前先用 DNase I 来处理 RNA ，以避免由酚——氯仿抽提时造成的 RNA 的损失。我们在实时 RT － PCR 实验中验证了用 DNase I 处理有限 RNA 样品的效果，非常令人满意。
3. 如果实验样品 RNA 有限，可以用较易获得的同一种／基因型（人的来自 cDNA 的 RNA 或是来自鼠 cDNA 的鼠 RNA ）的 RNA 用于确定最优化的退火和信号读取温度。但是，从这些资源得到的 RNA 应该按照样品处理的方法进行同样的处理，因为 Tm 值会受到残留盐和其它方法的影响。
4. 有些引物对也许会在不同的引物退火温度和加热时间的情况下产生几个峰的融解曲线。这也许表明引物存在非特异性或者是表达存在不同的剪接转录本或者发现有新的基因家族成员。在这种情况下可以把反应样品从反应管中取出进行凝胶电泳并进行产物测序。
结论 :
采用热启动 PCR 和在特异产物 Tm 值以上进行荧光信号读取可以使基于 SYBR Green I 染料的实时 PCR 变得敏感而特异（ 10 ）。这里描述的技术可以使 cDNA 阵列中高和低强度杂交信号和 DD － PCR 中低到高强度信号的每个基因的 CV 值为 15% 。平均 CV 值低于通常报道的 25 － 25% 。大部分通过 cDNA 阵列和 DD － PCR 方法得到的差异基因可以通过实时 PCR 技术得到确证（采用 1 ： 200 到 1 ： 20000 的 cDNA 稀释， 20ul 反应体系中加入 1ul 的模板 RNA ）。因为实时 PCR 方法可以采用极低量的 cDNA ，验证由高通量方法得到的 100 － 1000 个基因只需要 1 m g 的总 RNA 。如采用 Northern 杂交或 RNase 保护方法进行验证，则至少需要 5 m g 的总 RNA ，这接近于采用实时 PCR 反应分析的 5000 倍。
实时 PCR 技术验证的不同表达强度信号的 DD － PCR 条带表明了对 DD － PCR 条带的验证并不依赖于条带的信号强弱。另一方面，杂交信号的强弱和基因的相对表达水平对 cDNA 阵列结果的影响也得到了验证。与采用的筛选技术相比，实时 PCR 得到的结果在基因表达水平上有很大的不同。这种不同也许是由于采用筛选技术和 DD － PCR 技术时没有办法采用特异性的引物来区分同一个基因家族。除非 DNA 阵列技术采用了针对序列特异转录本的优化，否则 cDNA 阵列杂交结果就有可能被交叉杂交或重复制的基因家族成员所遮盖。简单的，为 DD － PCR 条带设计特异性的引物也受到序列信息不足和新的转录本的限制。实时 PCR 方法作为一种辅助的验证方法，有可能成为只使用少量 RNA 的情况下，定量大量已知和新基因表达变化的快速的新途径。
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