O. Henegariu, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance and P.H. Vogt
Indiana University, Indianapoils, IN, USA and Heidelberg University, Heidelberg, Germany
摘要：
多重 PCR 通过在同一个反应中同时完成多个基因的扩增成为临床与基础研究领域中一种简便快捷的筛选检测方法。已有大量文献详细的讨论了通常影响 PCR 反应质量的条件，而在多重 PCR 中常见的困难和重要的实验因素却鲜见报道。本文使用多对引物对多重 PCR 的各种条件进行了研究。研究表明，对于成功进行多重 PCR 尤为重要的因素是：用于扩增不同基因的不同引物对之间的相对浓度、 PCR 缓冲液的浓度、循环温度、氯化镁和 dNTP 浓度间的平衡。在实验的基础上，本文给出了一个多重 PCR 的标准方法，并给出常见问题的解决办法。
介绍：
多重 PCR 就是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的 PCR 反应。这一方法最早报道于 1988 年 （ 6 ） ，已被成功的用于缺失分析 （ 2,8 ） ，突变 （ 14 ） 与多态性 （ 11 ） ，以及定量分析 （ 10 ） 与反转录 PCR （ 7 ） 等多个 DNA 检测领域。
PCR 反应中各种试剂的作用已被讨论过 （ 3,9,12,13 ） ，也已有许多研究团体对多重 PCR 的方法进行了描述。但是很少有人对影响多重 PCR 结果的因素（如引物浓度、循环条件等）进行过深入的讨论 （ 5,15 ） 。本实验使用常规含 KCl 的 PCR 缓冲液对 50 种基因的各种组合进行了多重 PCR 反应，针对伴随多重 PCR 的一些问题，如均一性差、某些基因难以扩出、重复性差等问题，对影响扩增的相关参数进行了研究。基于实验经验我们设计了多重 PCR 的标准方法 (Figure 1) ，并提供了对可能碰到的许多问题的解决方案，这对于临床与基础研究领域中使用 PCR 技术的工作者都会有所帮助。
材料与方法：
PCR使用的标准溶液和试剂
100 mM 母液的核苷酸 (dNTP) ( 购于 Pharmacia Biotech [Piscataway, NJ, USA] 或 Boehringer Mannheim [Indianapolis, IN, USA]) (25 mM each dATP, dCTP, dGTP and dTTP).
标准的 10xPCR 缓冲液 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) 包含： 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3[at 24 ℃ ], 15 mM MgCl 2 .
Taq DNA 聚合酶 (Life Technologies [Gaithersburg, MD, USA]; Perkin-Elmer).
二甲亚砜 (DMSO), 牛血清蛋白 (BSA), 甘油 (Sigma Chemical [St. Louis, MO, USA])
引物 (Genosys [The Woodlands, TX, USA]; Research Genetics [Huntsville, AL, USA])( 终浓度为 10–25 pmol/μL 。引物对 sY 用作检测 Y 染色体上的缺失 (8,16) ；还有 10–15 对引物用于检测 X 染色体上迪谢内肌营养不良基因 (DMD) (4) ；其余引物用于检测 12 号染色体上的多态性位点，引物按 Table 1 和 Figures 2b, 3b,5e 方案组合。
基因组 DNA 使用标准 SDS/ 蛋白酶 K 方法制备 (Boehringer Mannheim)
基本 PCR程序
PCR 反应体积为 25μL ，包括：灭菌的超纯水、 PCR 缓冲液 (1x) 、 dNTP 混合物 (200μM each) 、引物 (0.04–0.6μM each); DMSO, 甘油或 BSA (5%); Taq DNA 聚合酶 (1–2 U/25μL) 和基因组 DNA 模板 (150ng/25μL) 。先加入水，其它组分可以任意顺序加入，加样在冰上进行，加样完成后反应管直接从冰上转入预热到 94 ℃的循环仪加热模块或水浴中。对于放射性标记的反应，在反应开始前立即在 100μL 的反应混合液中加入 1 μCi [ 32 P] dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL,USA) 。使用 100μL 、 25μL 、 6.2μL 反应体积得到的结果相同，对于小的反应体积，加样（尤其是 dNTP ）至关重要。实验中使用了各种 PCR 仪，经过细微调节后都得到了好的实验结果。
PCR产物的凝胶分析
在 3%SeaKem ? LE 或 NuSieve ? (3:1) 琼脂糖凝胶 (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) 上对 X 、 Y 染色体上非多态性位点的 PCR 产物进行分离，电泳缓冲液分别为 1xTAE [0.04M Tris-acetate; 0.001 M EDTA (pH8.0)] 或 1xTBE [0.09 M Tris-borate; 0.002 M EDTA (pH 8.0)] 缓冲液，电泳在室温下进行，电场强度为 7–10V/cm 。 PCR 产物的上样体积相同，电泳后凝胶用 0.5–1 μ g/mL EB 染色。
当检测位点为多态性位点或需要更高的分辨率时使用测序胶 (6% 聚丙烯酰胺 [PAA]/7 M 尿素 ) 。与上样缓冲液混匀后，每泳道加入约 0.2 μ L 放射性标记的 PCR 产物。凝胶在 0.6xTBE 缓冲液中在 1800–2000 V (60A) 条件下电泳两小时。过夜曝光后得到自显影图像。
结果与讨论 :
在大量实验的基础上，如 Figure1 所示设计出了多重 PCR 的标准方法，其中也包括了许多经常遇到的问题的解决方案。为了便于使用，用斜体字将步骤表与材料和方法中的各点及以下部分联系起来。
多重 PCR反应的基本原理
DNA 引物（步骤 1 和 2 ） . 引物的选择遵从简单的规则：引物长度为 18-24bp 或更长， GC 含量为 35%-60% ，退火温度 55 ℃ -58 ℃或更高。长些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特 异性产物。使用软件 Primers 1.29( 从 ftp.bio.indiana.edu 下载的免费软件 ) 来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使 用 BLAST 工具在 NCBI 序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。
单基因的 PCR( 步骤 3). 首先设计了一个分别单独扩增所有基因的 PCR 程序。反应混合物包括： 1xPCR 缓冲液， 0.4 μ M 引物， 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶，共 25 μ L 反应体积。将在同一台 PCR 仪，在同型号的不同 PCR 仪上，在不同型号 PCR 仪上及在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。在同一台 PCR 仪上或在同型号的不同 PCR 仪上扩增，实验的重复性很好，但在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。实验表明对于 100-300bp 的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。对于单一 PCR 反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变 PCR 产物的特异性和产量。对于扩增 22Y 特异基因 (Figure 2a) ， PCR 程序 A 得到最佳结果 (Table 2) 。
多重 PCR ：等物质量的引物混合物（步骤 4 ） . 将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化 (Table 1 和 Figure 2b) 。初次进行多重反应时，各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。下面将解释并讨论一些优化的例子，由于许多参数被提及不止一次，因此这些例子并未严格遵照 Figure 1 中所列的步骤。
多重 PCR反应循环条件的优化
延伸温度（步骤 5 ， A-C ） . Figure 2c 展示了当加入相等量 (0.4 μM each) 的四种用于扩增 Y 染色体上不同基因的引物进行多重 PCR 时，用程序 A 和程序 B 扩增得到的结果 (Table 2) ，程序 B 有更高的延伸温度 (72 ℃ ) 和更长的退火和延伸时间。总的来说，用程序 A 对 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的扩增得到了更高产量的 PCR 产物。此外，用程序 B 扩增时某些产物消失 (Y-1 、 Y-2) ，同时出现了某些非特异性的扩增产物 (Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的结果更差一些，表明高的延伸温度减少了某些基因的扩增，尽管我们试图用长的退火时间和延伸时间来消除这种影响。
延伸时间（步骤 5 ， A, B 和 D ） . 在多重 PCR 中，由于同时扩增多个基因，酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。两个实验表明了延伸时间的影响。在一个实验中，一对 Y 染色体引物 (Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色体引物混合物 (X-3) 中。结果表明 (Figure 3b) ，多重 PCR 中增加延伸时间 ( 程序 A 与程序 D) 可以增加较长的 PCR 产物的产量。在另一个实验中，用程序 C 和 A （ Figure 3a 和 Table 2 ）扩增四个 Y 染色体上的基因。当延长延伸时间时，所有基因的 PCR 产物量都增加了。
退火时间和退火温度 （步骤 5 ， A-D; Figure 1 ） . 将退火时间从 20 秒改为两分钟并未改变扩增效率，但退火温度却是最重要的参数之一。尽管许多基因能在退火温度为 56 ℃ –60 ℃被特异的扩增，我们的经验表明 将退火温度降低 4 ℃ –6 ℃对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。 Figure 3, d–f 展示了这种情况，单独扩增时退火温度为 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火温度为 54 ℃时最优。尽管在 54 ℃时可能出现非特异性扩增（如 Figure 3c ），但多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响。相似的，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。这是由于在 PCR 反应中酶和 d NTP 的供应是有限的，所有的产物都是由同样的一组原料生成。
PCR 循环数 . 引物混合物 Y-3* 被用于扩增两个不同的基因组 DNA 样品，以不同的循环次数做多次实验 (Figure 4a) 。其中的一个基因组模板质量更高或 DNA 含量更高。可以看出，当循环数增加时，两组样品的各扩增带的产量都逐渐增加。 PCR 产物量增加最明显是在 25 个循环附近。通常对于一个反应， 28 至 30 个循环足矣，增加至 60 个循环对产物量无明显影响。
多重反应中试剂组分的优化
当使用同样的扩增程序时，不同的实验间存在差异 (Figures 2c 和 3a) 。解决重复性问题要求调节 PCR 反应组分。
引物的量 ( 步骤 5, B 和 C). 最初，在多重 PCR 反应中使用了相等物质量的引物（每种引物为 0.2–0.4 μ M ） (Figure 3c) 。但是扩增并非均一的，即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显。解决这一问题，要求改变反应中各种引物的比例，要增加”弱”基因的引物量，而要减少”强”基因的引物量。不同基因相对的引物终浓度有明显的差异 (0.04–0.6 μ M) ，这完全取决于经验。
dNTP和MgCl 2 的浓度（步骤 5D）.
dNTP. 用引物混合物 Y-4 检测了多重 PCR 反应中 dNTP 浓度的影响。氯化镁浓度保持恒定 (3 mM) ，而 dNTP 的浓度从每种 50 μ M 逐渐增加到每种 1200 μ M(Figure 4b) 。当 dNTP 浓度为每种 200 μ M 和每种 400 μ M 时结果最好，浓度继续增加时扩增被迅速抑制。降低 dNTP 浓度 (50 μ M) 不抑制扩增，但扩增产物的量会减少。 dNTP 母液对于反复冻融十分敏感，反复冻融 3–5 次后，多重 PCR 反应常常不能很好进行，扩增产物几乎完全不可见。为了避免这一问题，应分装出小份的 dNTP(25 mM each, 2–4 μ L, 10–20 次反应 ) ，冻存于 -20 ℃，使用前离心。 dNTP 的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。
MgCl 2 . 在 dNTP 浓度为每种约 200 μ M 的标准 PCR 反应中 MgCl 2 的浓度建议为 1.5 mM 。为测试 MgCl 2 的影响，将 dNTP 浓度保持在 200 μ M 进行多重 PCR 反应 (mixture Y-3) ， MgCl 2 浓度从 1.8mM 逐渐增加到 10.8 mM (Figure 4c) 。随着 MgCl 2 浓度的逐渐升高，扩增反应的特异性逐渐增强（非特异性条带消失），产物量逐渐增多 (10.8 mM) 。在 MgCl 2 浓度为 20 mM 的 PCR 反应中，产物几乎不可见，似乎反应被抑制了。
dNTP/MgCl 2 的平衡 . Taq DNA 聚合酶正确工作时需要游离的镁离子 (9) （不包括与 dNTP 和 DNA 结合的镁离子）。这也许是 dNTP 浓度增加时扩增反应被迅速抑制 (Figure 4b) 而增加镁离子浓度能消除这种抑制现象 (Figure 4c) 的原因。通过对各种 浓度 dNTP 和 MgCl 2 的组合实验发现，浓度为每种 200 μ M 的 dNTP 要得到最好的扩增结果需要 1.5–2 mM MgCl 2 ，而浓度为每种 800 μ M 的 dNTP 要得到最好的扩增结果至少需要 6–7mM 的 MgCl 2 。浓度为每种 200 μ M 的 dNTP 扩增反应要求的 阈 值为 1 mM MgCl 2 ，当 MgCl 2 低于这一阈值时，扩增会减少。
PCR 缓冲液（ Kcl ）的浓度 . PCR 缓冲液的比较 (Step 5, B–D).
KCl 或 PCR 缓冲液浓度 . 提高 PCR 缓冲液的浓度为 2x （或仅将 KCl 的浓度增加到 100mM ）可以提高多重 PCR 的效率 (Figure 4d 及 Figure 3, d–f) ，这种调节作用比调节 DMSO ，甘油或 BSA 更重要。通常产生长片断扩增产物的引物在低盐浓度下扩增结果更好，而产生短片断扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好，高盐浓度会使长片断扩增产物难于变性解链 ( 比较 Figure 4d 中 0.4x 缓冲液与 2.8x 缓冲液 ) 。例如， sY94 引物对 ( 熔点为 58 ℃ ) 在缓冲液的浓度为 0.8x 时扩增效果优于 sY88 引物对 ( 熔点为 58 ℃ ) 和 sY151 引物对 ( 熔点为 52 ℃ ) ，但在高的盐浓度条件下， sY94 引物对的扩增效果无明显优势。合适的缓冲液浓度可以克服产物大小和 GC 含量等因素的影响。
PCR 缓冲液的比较 . 我们还比较了原先提到的被称为 DMD 的多重 PCR 缓冲液 (6) 和相对简单的 KCl 缓冲液在多重 PCR 反应中的差异。 5x 的 DMD 缓冲液含有 83 mM(NH 4 ) 2 SO 4 , 335 mM Tris-HCl (pH8.8), 33.5 mM MgCl 2 , 50 mM β -mercaptoethanol （β－巯基乙醇）和 850 μ g/mL BSA ，缓冲液 DMD 的使用终浓度为 1x ，与 10% DMSO 和 1.5 mM each dNTP 同时使用 (1,2,4) 。实验表明用 1.6x 的常规 KCl 缓冲液比用 DMD 缓冲液扩增 DMD 基因 ( 引物混合物 X-1) 效果更好，明显见到更多的 PCR 产物 (Figure 4e) 。实验结果使用病人的 DNA 样品做了十二次重复，重复性很好。 KCl 缓冲液相对简单，便于调节和优化实验。低 dNTP 浓度时 Taq DNA 聚合酶的保真性更高 (9) 。使用 KCl 缓冲液（要求更少的 dNTP ）有利于对 PCR 产物做进一步的突变分析。
模板 DNA 的量和 Taq DNA 聚合酶 ( 步骤 5, A 和 D). 当每 25 μ L 反应体积中 DNA 的模板量为 30ng 到 500ng 时，混合物 Y-3* 未表现出明显差异 (Figure 4f) ，然而当模板量低于 30ng 时，某些 PCR 产物的量会减少。当模板量很低时（ pg 级的 DNA ），扩增的效率与特异性可以通过进一步降低退火温度来优化，有时甚至要降低 10 ℃ –12 ℃（数据未显示）。使用引物混合物 Y-3(Figure 5a) 来测试不同 Taq DNA 聚合酶的浓度 (Perkin-Elmer) 。 Taq DNA 聚合酶的最适浓度为每 25 μ L 反应体积中 0.4 μ L 或 2U 。也许是由于 Taq DNA 聚合酶中甘油浓度过高，加入过多的 Taq DNA 聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高。在 1.6xPCR 缓冲液中使用自制的五种不同来源的 Taq DNA 聚合酶（每 25 μ L 反应体积中加入 2U ）对 Y-4 引物混合物的反应体系扩增得到了相似的结果 (Figure 5b) 。
佐剂的使用： DMSO, 甘油 , BSA (Step 5E). 许多作者建议使用浓度范围为 5%–10% (v/v) 的 DMSO 和甘油来改善扩增的效率（提高产物量）和特异性（没有非特异性产物） (9) 。然而在多重反应中， DMSO 的使用会给出矛盾的结果。例如， 5% DMSO 增加了某些基因的产物量，减少了另一些基因的产物量，而对某些基因却没有任何影响 (Figure 5c) 。使用 5% 的甘油也得到了相似的结果。因此， DMSO 和甘油的调节对实验结果的影响要根据具体的实验来摸索。加入浓度达 0.8 μ g/ μ L BSA （比以前描述得更高）比加入 DMSO 和甘油更能提高 PCR 扩增的效率。 BSA 对任何基因的扩增都未产生抑制作用。
琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖 . 长度彼此相差 30–40bp 的多重 PCR 产物在通常使用的 SeaKem 或 NuSieve(FMC BioProducts) 3% 的琼脂糖凝胶可以很好的区分开。在低电场强度下过夜电泳可以优化每个 PCR 产物条带的电泳效果，特别是当 PCR 产物小于 400–500 bp 时。
聚丙烯酰胺凝胶 . 为了分离长度仅差几个 bp 的 PCR 产物（例如微卫星标记）需要使用浓度 6%–10% 的聚丙烯酰胺凝胶 (PAA 胶 ) 。非变性 PAA 胶可以有效的区分非多态性基因，但在这种胶上分离微卫星片断会出现不正常条带。例如在分析含有单拷贝人类第 12 号染色体的两个杂交瘤细胞系的人类第 12 号染色体上某个多态性位点时，对于每一个被检测的基因位点，在非变性 PAA 胶上都出现了两个条带 (e.g., Figure 5d) 。在常规的 6% PAA/7 M urea 测序胶上，每个被检测的基因位点都仅有一条带 ( 比较 Figure 5, d 和 e 的产物 ) 。
我们用一系列样品检测了多个参数来优化多重 PCR 。对于任何 PCR 反应，为了获得高特异性的扩增产物，退火温度和 KCl 浓度（盐浓度）的最优组合是最重要的。 Mgcl 2 浓度应当与 dNTP 的量成比例，对于任何反应这个比值可以是常数。虽然逐渐提高 MgCL 2 浓度可以增强反应的特异性，但是看起来退火温度和 KCl 浓度（盐浓度）对于获得高产量的特异性 PCR 扩增产物更为重要。在多重 PCR 中调节每一个基因的引物量也很重要。 Figure 1 给出了进行高效的多重 PCR 的有效方法。尽管无法完全列出影响 PCR 反应的所有因素。然而本研究中所提到的参数的优化提供了解决多重 PCR 中常见问题的基本方法。
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