实时定量PCR技术及其应用

肖云刚  宁夏大学生命科学学院，2002级生物技术（1）班
摘 要：实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测，快速，灵敏，精确等特点，是对原有PCR技术的革新，扩大了PCR的应用范围.本文综述了RQ-PCR技术的原理及其应用。 关键词：实时定量，PCR,基因，荧光探针，应用 聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction)(PCR)首见报道于1985年，是一种体外扩增DNA片段的技术，已经广泛应用于人类遗传病的基因诊断，产前诊断，临床医学如传染病致病原细菌即病毒的检测，肿瘤，白血病的诊断，癌基因探索等，在分子生物学中应用于基因组DNA或mRNA序列的直接测定，基因分离，克隆，定点致突变，基因突变的直接检测以及法医学等。之所以如此，是由于通过PCR可使极少量复杂的基因组DNA或总RNA样品中特定基因片段，在短短几小时内扩增上百万倍拷贝。 PCR技术自问世以来得到了不断发展，20世纪90 年代发展起来的由美国Applied biosysems公司推出的实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基因利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它除了具有PCR的高灵敏性外，还具有可直接监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果，精确性高；定量和扩增同步进行，克服了PCR的平台效应；特异性和可靠性更强；能实现多重反应；无污染性；具实时性和可靠性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究领域和医学研究等领域。 1：实时定量PCR技术的概述 1. 1两个重要概念的说明 （1）荧光阈值（threshold）:以PCR反应的前15个循环的荧光信号，一般荧光阈值定义为3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 （2）Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle,t代表threshold。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值是所经历的循环数（如图1所示）。经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图2所示）。这样，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 11.2 作用原理 RQ-PCR技术是指在PC反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。实时定量PCR常用的检测模式有TaqMan探针和SYRB Green 1检测模式。 （1） TaqMan探针方法的作用原理 这种方法的原理主要是利用DNA的5’-3’核酸外切酶（常用Tap酶）活性并在PCR过程中,反应体系加入一个荧光标记探针.TapMan探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:常规TapMan探针和TapMan MGB探针。 常规TapMan探针利用合适的DNA的5’-3’核酸外切酶（常用Tap酶）活性，特异性的切割探针5’端的荧光基团。该探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团FAM（6-羧基荧光素）和一个淬灭荧光基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。当溶液中有PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET,发出荧光。 2000年，美国Applied Biosystems公司开发了一种新的TapMan探针—-MGB探针。这种荧光探针与常规TapMan探针相比，有两个主要的不同：一是探针3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记。这使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以大大改善。二是探针3’端另结合了MGB(minor groove binder)结合物，使得探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性，使结果更精确，分辨率更高。实验证明，TapMan MGB探针对等位基因的区分更为理想，甚至能检测仅有单核苷酸差异的等位基因的表达水平。 （2）SYBR Green ┃荧光染料方法的作用原理 SYBR Green ┃是一种只与双链DNA小沟结合的染料，当它游离在溶液中时，不发出荧光；一旦掺入DNA双链，便发出强烈的荧光。但是当它从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系中，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。它的最大优点是能用于任何模板的任何一对引物。它的缺点也在于能与非特异性双链DNA结合，但是它产生的干扰可通过熔解曲线分析得以解决。 2.实时荧光定量PCR技术的应用 2. 1基因工程研究领域 (1)基因表达研究 RQ-PCR方法能检测各种组织细胞中基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控，监控mRNA表达模式，检测组织中少量存在的基因，跟踪群体细胞中克隆型，定量分析基因在不同组织中的转录水平等。此外，RQ-PCR也用来研究各种处理如受病毒感染对细胞mRNA含量变化的影响，锻炼等对mRNA表达的影响，以及比较感染组织与正常组织中各mRNA含量，不同组织中基因表达情况等。 （2）转基因安全检测 现在转基因产品很流行，但是，在转基因食品，疫苗和治疗中介如外源物质可能引起危险。因此在安全检测中，利用高敏感的PCR来检测这些物质是很关键的。RQ-PCR可用于对转基因产品的检测和定量。根据目前转基因技术中使用的基因构件主要来源于花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子和农杆菌的NOS终止子，绝大部分转基因产品中含有这两个基因片段，用RQ-PCR检测定量35S启动子和NOS终止子就可达到简便，快速，准确的检测转基因产品的目的。 此外，RQ-PCR在动物中基因治疗载体的生物分布的确定，生物疗法中残留DNA的含量，污染细胞库和终产物中病毒和细菌核酸检测等生物安全检测中都有广泛应用。 （3）单核苷酸多态性(SNP)及突变分析 实时定量PCR的一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交则完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体的稳定性，从而降低其溶解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。 2.2医学研究领域 （1） 病原体检测 RQ-PCR技术可以快速，准确定量的测出高至1010，低至100个拷贝数的病原体，定量范围极宽。过去人们对乙肝病毒(HBV)的检测主要依靠间接指标—-乙肝表面标志物。但是仅仅根据HbsAg阳性或阴性，在临床医学中很难判断患者体内病毒是否处于复制期，病毒复制的量又如何，以及患者是否具有传染性等。常规PCR方法也能定性检测HBV,但是RQ-PCR能快速和精确定量，更好解决这一难题，如RQ-PCR检测HBV-DNA的结果为101~105拷贝/ml时，表明病毒复制水平低，传染性较弱；而当HBV-DNA大于105拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性较强。另外，HBV-DNA的定量检测可及时灵敏地监测患者药物治疗的效果。 目前，用此方法还进行了对人类免疫缺陷病毒，结核病毒，巨细胞病毒，EB病毒，流感病毒A,流感病毒B等病原体的检测。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生，发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。 （2） 肿瘤研究 肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现。RQ-PCR不但能有效地检测基因的突变，而且能准确测定表达量，可进行肿瘤的早期诊断和治疗效果及预后的判断 目前应用实时定量PCR技术检测基因异常变化的方法已进行过端粒酶hTERT基因，慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因，肿瘤ER基因，前列腺癌PSM基因，肿瘤相关的病毒基因的表达检测。 3．RQ-PCR技术展望 RQ-PCR技术的准确，灵敏，快速和经济给人们带来了极大的方便和利益，大大降低了假阳性率，工作效率高，结果重现性好，而且不必使用对人体有害的染色剂。现在RQ-PCR技术广泛的应用于医学方面，主要是在病原体检测方面。在植物学，动物学等领域中应用的不多。但是随着RQ-PCR技术与生物芯片技术，肽核酸技术，微解剖技术等先进技术的整合，相信RQ-PCR技术的应用前景将越来越广阔。 参考文献 章静波 细胞生物学实用方法与技术，1995，1：332-335 赵寿元 等.基础细胞生物学，2002，1：304-307 熊爱生 等.遗传学报，2002，29（11）：1034-1040 郎春秀 等.植物生物学通讯，2002，38（4）：366-367 王梁燕 等.细胞生物学杂志，2004，26（1）：62-67 欧阳松应 等.生命中的化学，2004，24（1）：74-76 Real-Time Quantitative PCR and Its Applications NAME:XIAO Yun Gang NO.:12002244128 (College of life sciences,Ningxia University) Abstract:Developed in the mid 1990s for the analysis and quantification of nucleic acid,real-time quantitative PCR is a molecular biological technique gaining rapidly in popularity.The advancement provided by the real-time version of PCR is due to its unique ability to monitor the complete DNA amplification progress and other features such as rapidness ,sensitivity and accuracy.Real-time Quantitative PCR has reformed the conventional PCR as well as enlarge applications.This article reviews the principle and some applications of this new technique.
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