平时，经常会碰到一些私信或公众号后台向我提问的FLOWER，我通常都是马上拒绝，并邀请他们到论坛提问，因为公开的讨论会使得更多站友参与，往往，其它站友会有意想不到的经验分享，尤其是科研方面的话题。
这不，这次就是由一个《人外周血T细胞亚型分析》帖子开始的讨论，楼主提问一个T细胞亚型检测方案如何组成比较合理，然后逐渐讨论到PMA刺激后CD4表达降低如何检测，我提出了可以染胞内CD4，以避免CD4在PMA刺激后内吞导致假阴性或荧光减弱的情形，然而在讨论到13楼的时候，我们的热心站友@小憨 提出了：
如果担心CD4内吞的话可以先标记CD4再刺激。配色可以将IFN、IL-4和IL-17标记在同一个样品里，这样可以直接显示他们之间的比例，也许有既分泌IFN和IL-17的细胞，分开染色就不能反应出这一部分的信息了
此时，我就有点疑问了，CD4先标记后，在刺激的几小时孵育中，CD4的荧光素会不会受影响，此时，另一位热心站友@hbezyr 就十分有经验了，他指出了，在检测NK细胞活化功能时，CD107a就是在刺激之前加入的。
我找到了相关文章《CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity》 Journal of Immunological Methods 294 (2004) 15–22，发现确实如此，并且该文章中采用的CD107a用的还是串联染料，PE-cy5。（注：如需阅读此PDF全文，请点击“阅读原文”跳至论坛第18楼）。
那么由此推论，对于荧光素标记的抗体，其实37度对其影响不大，即使是串联染料也一样，相比之下，光照的影响更大，光照可导致荧光素发生淬灭，更会串联染料分解，例如PE-cy7分解为PE和cy7，导致相关通道假阳性。所以，平时的实验中，大家更需要关注光照还是温度，现在应该有数了吧？
（责任编辑：lgh）
