郭巧梅 乔理华 王琳 娄加陶
肺癌是世界范围内癌症死亡的首要原因，其5年生存率仅为15%[1]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占全部肺癌患者的85%[2]，其主要病理类型是腺癌。然而，至今尚未开发出能够实时监控NSCLC疾病进展并有助于预后改善的检测手段。传统的肿瘤学检查主要依赖于组织病理学和影像学方法，组织学检验虽然是肿瘤诊断的金标准，但受限于无法多次进行活组织检查及可能带来的不良后果(如沿穿刺道播散)[3]，无法实现肿瘤进程的实时监控；而影像学检查难以发现微小的转移灶[4]。而血液一个反映人体健康信息的窗口，目前常用的NSCLC血液学检测方法是美国临床生物化学国家科学院推荐的NSCLC多联肿瘤标志物[癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA) ＋细胞角蛋白19 (cytokeratin-19 fragment，CYFRA21-1)＋鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC)][5]，但临床效果并不满意。
随着精准医疗概念的提出以及肿瘤靶向治疗策略的发展，液态活检(liquid biopsy)技术，尤其是循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)由于其获取简便、微创、易于连续监测的特点已成为精准医疗时代极具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测工具，其在肿瘤领域的临床应用价值值得探究。目前市场上的CTC检测技术和产品大部分是针对CTC的生物物理学特性设计的，但是由于存在CTC的纯度低、漏检率高等缺点，需要进一步开发更好的检测方法进行NSCLC的辅助诊断。本研究采用的人循环肿瘤细胞检测试剂盒利用免疫磁珠负向筛选与靶向PCR原理，既避免了对发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的CTC漏检，又利用了靶向PCR方法的优点，保证了对CTC检测的灵敏度和特异度。
对象与方法
一、对象
收集2014年10月至2015年4月上海市胸科医院诊治的经病史、临床表现、病理学确认的NSCLC初诊患者162例(根据《2015版WHO肺部肿瘤组织学分类标准》[6]，确诊肺腺癌115例，肺鳞癌28例，大细胞肺癌4例，肺腺鳞癌1例，其他类型的NSCLC14例)，男85例，女77例，中位年龄61岁(年龄范围21～79岁)，其中TNM分期采用国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC)2009年第7版分期标准(IASLC 2009)[7]，确定Ⅰ期83例、Ⅱ期16例、Ⅲ期27例、Ⅳ期36例。肺部良性疾病组119例，(包括肺良性肿瘤19例、气胸25例、肺大泡13例、肺结核9例、肺炎39例、其他类型的肺部良性疾病14例)，男72例，女47例，中位年龄52岁(年龄范围18～77岁)。选择体检中心的健康人52名，男12名，女40名，中位年龄33岁(年龄范围22～60岁)。
二、方法
1．仪器与试剂：
人循环肿瘤细胞检测试剂盒(格诺思博生物科技有限公司)，CEA、CYFRA21-1、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)定量测定试剂盒(上海透景生命科技股份有限公司)，SCC测定试剂盒(雅培贸易有限公司)，ABI 7500荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)等。
2．标本采集：
CTC检测样本用EDTA抗凝的真空采血管采集病人静脉血4 ml，上下颠倒7～8次使抗凝剂与血液充分混匀，4～8 ℃暂存，并在24 h之内进行检测；肿瘤标志物检测样本采集清晨空腹外周血2.5 ml，室温静置30 min，离心(2 700×g)后取血清2～8 ℃暂存，7 d内测定(参照试剂盒说明书要求)。
3．CTC水平检测：
采用人循环肿瘤细胞试剂盒，基本原理是免疫磁珠负向筛选富集CTC及配体靶向PCR的方法进行CTC检测及定量[8,9]。按照试剂盒说明书，其检测流程大致为：将12 ml细胞裂解液加入3 ml全血标本及6个标准品与3个质控品中，4 ℃裂解15 min，加入抗CD-45及抗CD-14的免疫磁珠4 ℃孵育30 min以吸附去除白细胞和巨噬细胞。然后，将富集得到的CTC与10 μl探针标记液室温孵育40 min后终止反应，将标记的CTC洗涤并洗脱下来进而在ABI 7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，循环条件设置为95 ℃变性2 min，40 ℃退火30 s，8 ℃冷却5 min；然后，95 ℃变性10 s，40个循环，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s。在35 ℃退火时检测荧光信号，检测结果以CTC Units/3 ml表示。
4．血清肿瘤标志物水平检测：
CEA、CYFRA21-1采用流式荧光发光法，SCC采用化学发光微粒子免疫检测法，各自的检测流程严格按照试剂盒说明书进行，并且试剂盒参考正常值推荐如下：CEA<5 μg/L，CYFRA21-1<5 μg/L，SCC<1.5 μg/L。本研究规定三者中任何一项高于正常值即为阳性。 三、统计学分析 应用SPSS 19.0软件(IBM，Chicago，USA)和Graphpad Prism 6 (GraphPad Software，San Diego, USA)分别进行数据分析和图表制作。外周血CTC水平经正态性检验，呈偏态分布，用中位数M(P25～P75)表示。采用Mann-Whitney U检验(两组)或Kruskal-Wallis检验(多组)，比较NSCLC患者、肺部良性疾病患者和健康人以及不同TNM分期及病理亚型的NSCLC患者的CTC水平是否有统计学差异，若多组检验差异有统计学意义，则进一步进行两两比较。采用χ2检验比较CTC检测与血清多联肿瘤标志物在Ⅰ期NSCLC患者中的诊断阳性率。所采用的统计学方法均采用Ⅰ类错误α为0.05、Ⅱ类错误β为0.2，双侧检验水准。P<0.05为差异有统计学意义。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)确定临界值(cut-off值)。 结果 一、受试者CTC水平比较 各组受试者全血CTC水平检测结果见表1。NSCLC患者组CTC水平(M＝11.90 CTC Units/3 ml)显著高于对照组CTC水平(肺部良性疾病患者组＋健康人组：M＝6.32 CTC Units/3 ml，Mann-Whitney U检验，U＝23 635.500，P<0.01，)；NSCLC患者组、肺部良性疾病患者组(M＝6.72 CTC Units/3 ml)和健康人组(M＝5.82 CTC Units/3 ml)CTC水平相比差异有统计学意义(Kruskal-Wallis检验，χ2＝125.990，P<0.01)；而肺部良性疾病患者组CTC水平与健康人组相比差异无统计学意义(χ2＝21.613，P＝0.531)。 二、NSCLC患者CTC水平与临床及病理学特征之间的关系 进一步分析不同TNM分期、病理类型及年龄、性别对NSCLC患者CTC水平的影响，统计学结果显示Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者CTC水平(中位数)分别为：Ⅰ期10.87 CTC Units/3 ml，Ⅱ期10.65 CTC Units/3 ml，Ⅲ期12.17 CTC Units/3 ml，Ⅳ期14.51 CTC Units/3 ml(表1)。Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者CTC水平相比差异有统计学意义(Kruskal-Wallis检验，χ2＝12.142，P<0.01)，其中Ⅳ期肺癌患者CTC水平显著高于Ⅰ期患者(χ2＝3.283，P<0.01)，而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者CTC水平相比差异无统计学意义(Ⅰ期与Ⅱ期：χ2＝0.413，P＝1.000；Ⅰ期与Ⅲ期：χ2＝-0.703，P＝1.000；Ⅱ期与Ⅲ期：χ2＝-0.851，P＝1.000)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者CTC水平相比差异无统计学意义(Ⅱ期与Ⅳ期：χ2＝-2.556，P＝0.064；Ⅲ期与Ⅳ期：χ2＝-1.962，P＝0.299)。 不同病理类型的NSCLC患者CTC水平相比差异无统计学意义(Kruskal-Wallis检验，χ2＝1.858，P＝0.602)，而NSCLC患者的CTC水平在不同年龄段(≤60岁与>60岁)及性别之间相比差异无统计学意义(Mann-Whitney U检验，H分别为3 211.000、3 168.000，P值分别为0.848、0.726)。
三、ROC曲线分析与临界值确定及诊断性能评估
以病理学结果作为金标准，以肺部良性疾病患者和健康人作为对照，将CTC检测结果绘制ROC曲线(图1)，以约登指数最大点对应的临界值决定CTC检测的临界值为8.74 CTC Units/3 ml，即当CTC水平≥8.74 CTC Units/3 ml判为阳性，此时CTC检测的灵敏度为77.16%(125/162)，特异度为90.06%(154/171)。AUC为0.8532(95% CI: 0.809 5～0.896 9)，其中，肺部良性疾病患者假阳性率为11.76%(14/119)，特异度为88.24%(105/119)；健康人的假阳性率为5.77%(3/52)，特异度达到94.23%(49/52)；Ⅰ～Ⅳ期肺癌患者诊断灵敏度分别为69.88%(58/83)、75.00%(12/16)、81.48%(22/27)、91.67%(33/36)，Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ期肺癌诊断灵敏度为73.02%(92/126)；在不同病理类型的NSCLC中，利用该方法进行CTC检测对肺腺癌的诊断灵敏度为76.52%(88/115)，肺鳞癌诊断灵敏度为71.43%(20/28)，大细胞肺癌诊断灵敏度为100%(4/4)；只有1例是肺腺鳞癌(CTC水平为9.71CTC Units/3 ml)，为阳性。
四、NSCLC多联肿瘤标志物与CTC检测对Ⅰ期NSCLC患者的阳性率比较
在67例病理组织学确诊的Ⅰ期NSCLC患者中采用该方法进行CTC检测和多联肿瘤标志物(CEA＋CYFRA21-1＋SCC)分别检测，比较二者的阳性率，前者为68.7%，后者为19.4%，差异有统计学意义(χ2＝32.98，P<0.01)。 讨论 CTC是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞[10]，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。外周血中CTCs检测在肿瘤的早期诊断、疾病监测、预后评估中起到很重要的作用。总结起来，CTC检测技术的核心在于细胞的富集和鉴别，主要包括以下几种：(1)以表面抗原和免疫荧光为基础的方法，如CellSearch系统，但由于上皮间质转化的存在，其对晚期肺癌患者的阳性率只有32%[11]；(2)以细胞大小差异和过滤为基础的方法，如：膜滤过分离肿瘤细胞技术(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)，其优势在于不依赖CTC的表面抗原，保持了CTC形态和活性，但获得的CTC纯度很低，甚至不超过10%，而且很容易丢失直径比较小的CTC；(3)以DNA/RNA为基础的检测方法，该方法非常灵敏，然而稍有污染就容易造成假阳性的结果[12]，而且缺乏特别明确的特异性标志物，极大的限制了其临床推广应用。因此，目前尚无一种检测手段可以适用于NSCLC患者外周血的CTCs检测[13]。 在一些癌症中叶酸受体(folate receptors, FRs)表达量很高，其中FR-α的表达具有很强的组织和肿瘤特异性，在肺癌，尤其是NSCLC细胞表面高表达(每个细胞表面有大约50万个)，而在健康人血液细胞中几乎无表达[14,15,16]，是理想的非小细胞肺癌CTC检测靶点。筛选出针对FR-α的高亲和力的配体分子，并将这种配体分子偶联一段可以被PCR检测出的寡聚核苷酸形成"配体-寡聚核苷酸偶合物"检测探针。在检测时，将此偶合物探针与含有CTC的标本孵育，让其与CTC的表面受体充分结合。然后洗涤去除没有结合的探针分子，再用特异性的洗脱液洗脱CTC表面结合的探针分子并通过定量PCR扩增来检测洗脱的探针分子来对CTC进行定量。通过这种方法，将1个CTC放大成至少50万个表面受体分子，然后通过荧光定量PCR将这50万个分子再高保真地进行放大扩增检测，从而实现对稀有CTC的检测，这即为人循环肿瘤细胞检测试剂盒的工作原理。该试剂盒集合了CTC免疫磁珠阴性分选方法对CTC的高获得率和CTC的核酸检测技术的高敏感性，具有明显的检测优势。 本研究共入组了162例NSCLC肺癌患者、119例肺部良性疾病患者、52名健康人，CTC检测结果提示这3组受试者的CTC水平差异有统计学意义。另外，外周血CTC在不同临床分期NSCLC患者的差异也有统计学意义，而在不同病理亚型的NSCLC患者中无差异，这与文献[17]报道肺腺癌患者中叶酸受体要高于肺鳞癌患者不相符，原因可能是由于CTC和原发性肿瘤中基因表达的不同[18]，导致CTC表面表达FR含量不同，另外本研究入组的大细胞癌和腺鳞癌病例数太少，可能会对统计结果造成部分影响。已有研究[9]表明，NSCLC患者FR-α表达水平约75.7%[16]，而利用FR偶联标记CTC的检测方法特异度高达99%，当确定以8.74 CTC Units/3 ml作为临界值时，该方法的灵敏度为77.16%(125/162)，特异性高达90.06%(154/171)，与先前研究结果基本一致；另外，ROC曲线下面积(AUC)>0.8，对肺腺癌和肺鳞癌具有较高的诊断准确性。而且，随着疾病进展，试剂盒对疾病的诊断能力越强。利用该试剂盒进行CTC计数发现，NSCLC患者外周血CTC水平与病理类型、年龄、性别无关(P值分别为0.602，0.848及0.726)，与已有研究[19,20,21]结果相一致。另外，在健康人和肺部良性疾病人群中也检测到了一定水平的CTC，可能是外周血中一小部分具有功能性FR表达的活化的单核细胞亚群[8]，也可能是表达FR的正常组织(如肺等)[14,15]脱落到外周血中的循环非血细胞(circulating nonhematologic cells, CNHC)[22]。
值得注意的是，NSCLC患者的外周血CTC水平离散程度明显高于肺部良性疾病及健康人群(四分位数间距分别为6.05、3.44及2.40)，说明NSCLC患者体内的CTC数量相差较大，而较高水平的CTC常与患者的预后呈负相关[11,23,24]，证实了CTC计数在肺癌诊断及预后判断中的应用价值。若能实现NSCLC的早期准确诊断、及时干预治疗可显著提高患者的5年生存率[25]。基于此，本研究比较了目前临床上常用的NSCLC多联肿瘤标志物与CTC检测在Ⅰ期NSCLC患者中的阳性率，发现其CTC检测对Ⅰ期NSCLC的诊断准确率明显高于多联肿瘤标志物，二者差异有统计学意义，这进一步证明了CTC检测即使对于Ⅰ期NSCLC患者也有较高的诊断价值。
由于肿瘤的异质性，肿瘤演变过程中也存在进化[26]，与原发部位相比，转移灶可能具有不同的基因改变。在治疗过程中，肿瘤也会发生各种基因型和表型的改变。因此，在肿瘤个体化治疗过程中动态监测肿瘤细胞及其基因变化是亟待解决的问题。利用该方法对术前术后、疾病不同阶段、复发和转移过程中外周血的CTC水平变化相关的疾病动态研究以及对小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)的诊断价值需要进一步的验证探究。
综上，本研究的CTC检测对NSCLC具有较高好的灵敏度和特异性，即使对Ⅰ期NSCLC也有较高的诊断阳性率，具有一定的临床应用价值。
（责任编辑：xgh）
