皮肤、肠道、呼吸道、泌尿生殖道等定植着大量的细菌，在长期与人类共同进化的过程中，这些细菌与宿主机体形成了一个互利共生状态。它们被称为正常菌群，参与宿主抵御感染、营养获得、免疫成熟、神经调节等过程。当这些正常菌群的稳态被抗生素的不合理使用、病原体(例如病毒)的侵入或其他因素所打破后，宿主就会继发各种疾病。虽然具体机制尚不明确，宿主患病可能与侵入病毒的类型[如呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)]、是否患有慢性疾病、机体免疫力、生活习惯、居住环境等因素相关[1,2]。
近年来，关于微生物菌群与人类健康和疾病的研究越来越多，并取得了突破性的进展。研究发现，肠道菌群紊乱与肝硬化、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、糖尿病等疾病关系密切[3]，其主要表现为菌群多样性降低，拟杆菌门含量相对减少，变形杆菌门和厚壁菌门等细菌含量相对增多。这些减少或增多的细菌代谢产物在疾病发生发展中发挥着重要作用。IBD患者肠道中产丁酸盐的罗氏菌属丰度降低，而丁酸盐具有辅助消化和消炎的作用[4]。
呼吸道菌群的紊乱与COPD、哮喘、CF和肺炎等呼吸道疾病的发生、发展和预后也有着相关性[5]。本文将对呼吸道疾病与呼吸道菌群的关系研究做如下综述。
一、微生物群落研究的技术发展
在各种生物环境中，约99%的微生物是不可培养的。宏基因组学(metagenomics)技术的成熟使不可培养微生物和微生物菌群多样性的研究成为可能。宏基因组学，于1998年由Handelsman等[6]提出，是以环境或动、植物中微生态的所有DNA为研究对象，通过对核糖体RNA的编码基因(如细菌16S rDNA，真菌18S rDNA)或者全基因组进行测序，以揭示微生态中微生物群落结构和多样性及其与环境因子的关系；得到在物种或功能基因上的丰度信息，进而结合一些代谢通路、信号通路、功能基因等数据库进行分析。由于全基因组测序价格昂贵，加之分析复杂，在目前呼吸道微生态(细菌组、真菌组学)的研究中，多以细菌16S rDNA、真菌18S rDNA或转录间隔区(internal transcribed spacer，IST)的部分片段为靶点，进行测序分析。基于全基因组测序技术的研究，如菌群的代谢活动、功能、毒力及耐药等与疾病的关系仍有待开展。
以Roche 454 GS FLX Titanium、Illumina Miseq和Life Ion PGM等为代表的二代测序平台，正在推动着微生物菌群的研究，其具有高通量、深覆盖度的特点。各种二代测序平台的主要技术参数如表1所示。
二、健康人的呼吸道菌群构成
健康人的呼吸道菌群构成及来源的鉴定对寻找可疑病原体具有重要意义。临床研究中常常取鼻咽拭子、口咽拭子、痰和支气管肺泡灌洗液样本进行分析以分别代表鼻咽、口咽和肺的菌群。健康人鼻咽菌群构成与皮肤相似，属水平主要以葡萄球菌属、棒状杆菌属和丙酸菌属等为主[7]。口咽菌群构成与漱口液同源，优势菌属为拟杆菌属、放线菌属及变形菌属[8]。肺的菌群的丰富度低于鼻咽和口咽菌群，由于取样困难，肺部菌群的来源及构成存有争议，有学者认为肺部细菌来源于上呼吸道[9]，另一些学者则认为肺部菌群来源于口腔，因为纤支镜取样时会带入上呼吸道菌群从而使之与上呼吸道菌群构成相似[8]。
健康人的呼吸道菌群也会因环境和个体的差异而受到影响。母乳喂养的婴儿比人工喂养的婴儿在第6周时鼻咽部棒状杆菌属和狡诈菌属丰度更高[10]。儿童接种7价肺炎链球菌疫苗后，鼻咽部肺炎链球菌丰度降低[11]。
三、微生物群与呼吸道疾病
1．COPD：
COPD是以持续气流受限为特征的疾病。气流受限通常呈进行性发展并与肺的异常炎症反应有关，严重影响着老年人的生活质量和死亡率。研究表明，对中度COPD的患者进行HRV接种，在第15天的痰液中，流感嗜血杆菌的载量和炎症细胞的计数增加；此外，血液中的中性粒细胞数也出现了增高；但是菌群的多样性和均衡性均无显著改变[12]。研究发现重度COPD的急性加重期则出现了另一种改变：在插管时间大于6 d的患者中，下呼吸道菌群的多样性出现下降，假单胞菌科的细菌定植增加，这可能与疾病的严重程度、导管的应用和急性加重期的诱因不同等有关[13]。
COPD发病与TNF-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、IL-5(interleukin-5，IL-5)、IL-10(interleukin-10，IL-10)和MIP-2α(macrophage inflammatory protein-2α，MIP-2α)等炎性因子的表达变化密切相关[14,15]。细菌感染往往会引起或者加重炎症反应，这主要表现为某些促炎因子上调或抑炎因子下调。
COPD急性加重期大多由感染引起，感染多来源于支气管肺内定植的细菌，一种或几种定植菌优势生长导致疾病的原因及疾病状态下细菌与宿主相互作用仍需要大量研究去探索。
Millares等[16]分析了稳定期和发作期的COPD患者的支气管菌群，结果发现：发作期菌群的细胞生长和死亡、转移和分解代谢相关基因下调，而其肿瘤和碳水化合物代谢相关基因表达增加，这为呼吸道菌群改变与疾病的研究提供了新思路。
2．呼吸道微生物群与哮喘：
哮喘是由多种细胞参与的慢性气道炎症，表现为气道对多种刺激因子反应性增高，已成为严重威胁公众健康的重要慢性疾病之一。
有研究认为，早期患有严重喘息性毛细支气管炎的婴幼儿发展为哮喘的几率增加，这可能与HRV和RSV共同感染或HRV单独感染引起鼻咽部的流感嗜血杆菌的丰度增加有关[17]。因为病毒感染能破坏呼吸道黏膜屏障，使得病原菌大量定植，进一步引起炎症反应和组织损伤[18]。一项前瞻性的队列研究发现，在急性上呼吸道感染和使用抗生素的婴儿中，流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和链球菌属在鼻咽部定植比例增加[5]。菌群改变除了与哮喘发生有关外，还对其有改善作用。实验证明，新生鼠暴露在屋尘螨环境中发生了哮喘，在2周后，呼吸道细菌定植增多，产生一种与PD-L1(programmed death ligand 1，PD-L1)相互作用Helios(-) Treg细胞，小鼠的气道高反应性下降[19]。以上研究都表明哮喘是一种与长期慢性呼吸道菌群紊乱和功能失调有关的慢性疾病，调整菌群构成可能会有效预防和(或)管理哮喘的发生和发展[20]。
3．呼吸道微生物群与CF等其他呼吸道疾病：
CF是一种隐性常染色体遗传病通常具有慢性梗阻性肺部病变，胰腺外分泌功能不足和汗液电解质异常升高等特征。Keravec等[21]发现在CF患者中首次检出铜绿假单胞菌定植的时间与呼吸道菌群的多样性呈负相关。
非囊性纤维性支气管扩张的肺泡灌洗液和痰液内也鉴定出了大量的致病菌(如，流感嗜血杆菌和肺炎链球菌)、条件致病菌和被常规微生物监测所忽视的细菌(例如韦荣球菌属、普氏菌属和奈瑟菌属)。细菌的多样性与1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)呈正相关，细菌群落的构成与FEV1、中性粒细胞计数及Leicester咳嗽评分明显相关[22]。
de Steenhuijsen等[23]在老年肺炎患者口咽部发现乳酸杆菌、罗氏菌属和肺炎链球菌的丰度增加，而韦荣球菌属、纤毛菌属和普氏菌属的丰度降低。他们进一步建立了一个基于上呼吸道标本5个菌群相对丰度的决策树模型，其用于诊断肺炎的灵敏度和特异度分别可达到84%和95%。
4．真菌与呼吸道疾病：
值得注意的是，真菌在呼吸道生态紊乱的过程中也可能发挥着重要的作用，其在哮喘、COPD和支气管扩张等疾病均有文献报道。Charlson等分别用16S rDNA和ITS测序技术检测肺移植患者的肺泡灌洗液内细菌和真菌的改变情况，研究发现移植组较正常对照组菌群的多样性下降，以念珠菌属或曲霉菌属为主的真菌则出现增加，而这样的患者更容易发生闭塞性支气管炎和感染等并发症[24]。真菌可能与细菌或病毒共同作用，引起肺部炎症和宿主免疫反应，继而使肺功能降低，最终导致疾病的恶化[25]。
Kramer等[26]的研究则持不同的观点，他们对那些处于CF的急性加重期且经抗生素规范治疗患者的痰标本进行分析后，发现真菌的丰度在不同的个体中并不一致，且数量很少，从而可认为这些检出的真菌属于呼吸带来的过路菌而非定植菌。
综上所述，菌群紊乱是疾病发生的原因还是结局尚不明确，但是细菌感染往往会引起或者加重炎症反应，导致疾病加重。因此呼吸道菌群的合理管理或能为呼吸道疾病防治提供新思路。
四、益生菌在防治呼吸道疾病的价值
益生菌可用于治疗肠道菌群失调相关疾病，如：腹泻、IBD、肥胖、2型糖尿病等[27]。这一治疗方式在呼吸道疾病似乎也有明显的效果。幽门螺杆菌可通过BATF3-CD103(＋)CD11b(-)树突状细胞分泌IL-10减轻高气道反应、支气管肺泡嗜酸性粒细胞浸润、Th2细胞释放细胞因子从而发挥对哮喘和过敏性疾病的保护作用[28]。但是，一项meta分析结果表明益生菌能降低特应性致敏作用和IgE水平，但不能降低儿童发生哮喘的几率[29]。
多项临床实验证实，在益生菌选择方面，不宜局限于一种正常胃肠道或呼吸道的优势细菌，多种益生菌复合制剂的疗效及其作用机制的研究有待展开。
五、总结
许多研究都提示微生物菌群在呼吸道疾病的发生和发展中承担着重要角色。健康人的呼吸道定植菌群对感染和过敏性物质有防御作用，然而疾病中致病菌的丰度增加会引起炎症和免疫反应，导致病情加重。是什么打破了正常黏膜微环境的保护作用，能否预防？正常的黏膜微生态是怎样的，是否不同人对不同的疾病有不一样的易感性？这些问题仅靠菌群失调或者某些菌属增加来解释是远远不够的。未来的方向必将是对微生物菌群、黏膜屏障和黏膜免疫等问题进行整体性研究。此外，肠道菌群与呼吸道疾病是否有关，作用机制是什么？带着这些问题去思考，以不断更新的实验技术为长矛，我们将会揭开微生物菌群在急、慢性呼吸道疾病发生和发展过程中所发挥的作用机制的神秘面纱，并且可以通过检测微生物菌群、功能基因或者代谢产物的变化为临床提供有意义的信息。
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