一、质评标本鉴定的基本原则和思路
1. 选择合适的琼脂平板
根据标本来源部位，分析可能出现的病原菌，选择合适的培养基（表），与常规培养基种类一致。
2. 冻干标本的融化
在生物安全柜内无菌操作开启干燥菌种管，取0.2～0.3ml肉汤加入菌种管中，置35℃温箱10min后取出，混匀。
3. 培养
用无菌滴管吸取融化混匀的质评标本，分别接种在相应的琼脂平板上（已恢复至室温）一滴，分三区或四区充分划线，血平板和巧克力平板置5~10%CO2的环境下35℃培养18～24h。
4. 涂片染色
挑取1环菌悬液涂片，干燥后染色镜检，初步了解每份标本含有细菌还是真菌、一种菌还是多种菌，以及被检菌的革兰染色属性和形态、排列等特征。
5. 观察脂平板培养结果
若是来源于有正常菌群部位的标本，需排除正常菌群，仔细辨认可疑致病菌，分别挑取可疑菌落进行涂片、进行革兰染色，必要时做抗酸染色。原始平板继续培养至少3天，特殊来源标本培养观察至第5天（如奴卡菌或快生长分枝杆菌）。
不同标本可能的病原菌及合适的培养基
标本种类
可能致病菌
接种平板
试验说明
阴道标本（子宫、阴道拭子、后穹隆穿刺液）
男性尿道分泌物
淋病奈瑟菌、阴道加德勒菌、B群链球菌和酵母样真菌
血琼脂平板（最好兔血平板）、GC培养基（分离淋病奈瑟菌）、沙保培养基、真菌显色平板
鉴定主要病原菌
尿、导管
革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和真菌
血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板、真菌显色平板
鉴定主要病原菌
伤口分泌物、脓肿脓液
鉴定主要病原菌
痰、咽拭子标本
肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、白喉棒杆菌、β-溶血链球菌、卡他莫拉菌和真菌。婴儿鼻咽拭子需考虑百日咳杆菌
血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板、沙保培养基、真菌显色平板、百日咳杆菌专用的B-G琼脂平板
鉴定主要病原菌
粪便标本
弯曲菌、弧菌、沙门菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、难辩梭状芽胞杆菌、致病性大肠埃希菌
XLD、SS、TCBS/双洗、麦康凯、山梨醇麦康凯、血琼脂平板等琼脂平板
鉴定主要病原菌
脑脊液
脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、产单核细胞李斯特菌、新型隐球菌
血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板、真菌显色平板、沙保弱琼脂平板（新型隐球菌生长优于真菌显色平板）
鉴定所有病原菌
血液、骨髓、胸腹水、胆汁标本
革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和真菌
血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板、真菌显色平板
鉴定所有病原菌
*注：上述所有标本需加种营养琼脂平板，革兰阳性菌作触酶试验，革兰阴性菌作氧化酶试验。
6、细菌鉴定
对革兰阳性球菌，首先根据血琼脂平板上的菌落颜色、大小、溶血等特征，涂片染色，镜下形态作初步鉴定，然后做触酶试验，区分葡萄球菌属与链球菌属，、触酶阳性菌落做凝固酶试验，再选择革兰阳性菌鉴定卡上机鉴定；对革兰阴性杆菌，为了快速准确，先做氧化酶进行初步鉴定，确定其是肠杆菌科细菌、非发酵菌、弧菌科细菌还是其他菌，然后按各自的鉴定程序选择相应的鉴定卡上机或同时做双糖铁、动力试验等生化反应。
有些细菌生长缓慢，18～24h很难见到菌落，则应继续培养。有时会遇到培养18～24h后生化反应特性并不典型，可能是因为质控标本为冻干粉，其不同于临床标本，需传代2～3代（使细菌复苏）后生化反应才比较典型。
7、结果报告
仪器细菌鉴定结果出来后，需再次观察原始平板上的菌落特征和细菌涂片的结果，判断仪器鉴定结果与平板上的菌落是否相吻合。因为机器也会出现错误，例如洛菲不动杆菌由于生化反应不活泼，常被仪器鉴定为莫拉菌，这时就要重复做氧化酶试验，并对照原始平板菌落特征判断是洛菲不动杆菌还是莫拉菌。核实后再报告菌种名，必要时再用第二种方法鉴定。
8、药敏试验
根据标本来源和分离的细菌种类，按照最新的CLSI选药原则选择合适的抗菌药物进行药物敏感试验。（CLSI中的A类抗生素必须选择，B类抗生素最好也选择在内，C类选择常用的抗生素，尿液标本U类抗生素必须选择）。例如鉴定结果为金黄色葡萄球菌，应选择青霉素、苯唑西林（头孢西丁）、红霉素、万古霉素、克林霉素、氯霉素等抗菌药物作体外药敏试验（K-B法、MIC两种方法进行对照）。如果标本鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌，药物敏感试验应选择米诺环素、左氧氟沙星和复方磺胺甲恶唑，其他药物只允许报告MIC结果。
二、药敏结果的解释或评论
应掌握和熟悉CLSI规定的药敏试验的要求，及时了解新的变化，对细菌药敏结果进行分析，必要时根据CLSI进行修正，这样可以准确地报告药敏和结果评论。例如金黄色葡萄球菌药敏试验结果见表。
表 金黄色葡萄球菌药敏试验结果
抗菌药物名称
纸片剂量（µg/片）
抑菌环直径（mm）
MIC（µg/ml）
检测结果SIR
报告结果SIR
青霉素
10
13
0.5
R
R
苯唑西林
1
10
8
R
R
红霉素
15
10
16
R
R
万古霉素
2
S
S
克林霉素
2
22
0.5
S
R
头孢西丁
30
18
8
R
R
氯霉素
30
22
4
S
S
结果结论
同时测定苯唑西林与头孢西丁抑菌圈或MIC值，其中任何一种耐药则报告对苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA），应对全部β内酰胺类、酶抑制剂类抗菌药物的结果进行修正，无论其体外试验敏感与否，全部判定为耐药。对红霉素耐药、克林霉素敏感的葡萄球菌如临床需要使用克林霉素，应作“D test”。该菌株“D test”阳性，所以报告克林霉素为耐药。
三、鉴定过程中的要点
1. 按日常标本处理
把室间质评标本放入临床标本中, 由常规工作人员按日常标本一起处理（用同样的培养基、生化试剂、鉴定卡等）。微生物室人员共同参与、轮流操作，这样可以提高每个人的微生物鉴定能力，保证临床标本和质评标本结果的准确性，还可以反映出本参评实验室的水平。
2.坚持做好室内质控
定期用标准菌株进行培养基、药敏纸片、生化试验（如：3%过氧化氢，奥普托欣，氧化酶及β-内酰胺酶）及抗血清等的质量控制，以确保试验结果的准确。
3.混合感染标本
一份(质控)标本可能会存在2种或2种以上的致病菌，应注意不要漏检。在2003年卫生部质控中，粪便标本中含有肠炎沙门菌和志贺菌(图25-1)，有的实验室错误地认为不会同时存在两种病原菌，仅报告其中一种。
4.皮肤定植菌的判断
对于伤口分泌物标本，应注意皮肤定植菌的判断。曾有伤口分泌物质控标本，分离出表皮葡萄球菌，错误地认为是致病菌，却忽视了表皮葡萄球菌是皮肤的定植菌。检查接种的原始平板，发现标本中有表皮葡萄球菌和少量侵蚀艾肯菌混合生长，因侵蚀艾肯菌生长缓慢，18～24h肉眼不易观察到，而表皮葡萄球菌生长占优势，掩盖了真正的致病菌。
5.类似菌的鉴别
如在一次室间质评活动中，痰标本中除肺炎链球菌外,还有正常菌群的草绿色链球菌，应仔细辨别之间的特征，两者均有草绿色溶血环、针尖大小菌落，但肺炎链球菌有脐窝状凹陷，而草绿色链球菌的菌落是突起的，应选择可疑菌落进行胆盐溶解、Optochin、胆汁七叶苷等试验鉴别。还有曾遇到过伤口分泌物标本中分离出洋葱伯克霍尔德菌（图25-3），该菌在血琼脂平板中菌落的形态、颜色与嗜麦芽窄食单胞菌比较相似，容易误检。但在麦康凯琼脂平板上两种菌落的颜色、大小有差异。所以应该同时观察不同的平板，有利于辨别相类似菌之间的差异。
6.标本中意外出现的致病菌
一般情况下，根据标本来源，就可以初步考虑可能出现的致病菌，但也有例外。曾经在痰质控标本（患者曾经看过性病门诊，又因咳嗽、咳痰去呼吸科门诊就诊）中同时存在正常菌群的奈瑟菌和淋病奈瑟菌，往往会首先怀疑是卡他莫拉菌，而不会考虑是淋病奈瑟菌，因为淋病奈瑟菌的常见标本来源是生殖道分泌物。这种情况下，应仔细辨别菌落特征和生化反应特点。淋病奈瑟菌的菌落水滴状、无色透明、灰白色，分解葡萄糖、硝酸盐还原试验阴性，而卡他莫拉菌的菌落表面干燥，整个菌落可以用接种环推移，不分解葡萄糖、硝酸盐还原试验阳性。所以在分离和鉴定致病菌时,应根据标本来源初步推测判断可能出现的致病菌，还需要结合病史,以免造成不必要的漏检。
7.质评标本细菌不生长的原因
如果遇到质评标本转种平板后没有细菌生长，有可能挑取的标本量过少，或者因接种环加热后未等到冷却后接种而导致细菌死亡。培养时间过短，由于质评标本是模拟标本，不同于临床标本。需延长培养时间，有些苛养菌（如人心杆菌）生长缓慢，应在不同时间（24h、48h、72h）仔细观察，以免漏检。若还不生长，应从备份的原始菌种管中取干粉重新接种。
8.血清凝集反应的判断
血清凝集反应是鉴定细菌的一项重要手段，如沙门菌属、志贺菌属、致病性大肠埃希菌，在经过生化反应等鉴定到种水平后,再做血清的凝集反应,不能未经生化鉴定直接做血清学鉴定，因不同属中的不同种之间的抗原交叉现象经常存在，例如在WHO微生物质控中，曾遇到不活泼大肠埃希菌误报为鲍氏志贺菌，G群链球菌误报为F群链球菌，均由交叉凝集所致。因此在鉴定志贺菌、链球菌、沙门菌等时，不可仅凭血清学试验结果来判断，还应该同时进行生化试验来加以验证。
9.药敏质控
室间质评菌株(冻干粉)要传代后做药敏，分纯后挑选3个相似的菌落，防止可能存在的异质性耐药的菌株。对于没有纸片法药敏折点的药物/菌株，应采用检测MIC值的方法。
10.结果报告
最后出报告时应该再次检查原始平板有无慢生长细菌出现，因为有些致病菌生长比较缓慢如快速生长分支杆菌、苛养菌等，需要延长培养时间，尤其是快速生长分支杆菌；针对革兰染色是阳性杆菌（或阴阳不定）的细菌，最好加做抗酸染色，以确定是否为快速生长分支杆菌。
11.经验总结
微生物检验人员应掌握和熟悉CLSI规定的药敏试验的要求，及时了解新的变化，阅读最新的参考书籍，更新知识，了解新技术，不断完善SOP文件，掌握一些疑难菌和不常见菌的鉴定思路和方法。对于难以鉴定的细菌，应选用仪器、手工等多种方法，必要时要重复试验，要抓住一些关键试验。综合分析，以达到正确的鉴定结果。参加室间质控不仅是为了好的成绩，更重要的是为了提高临检验人员的鉴定水平。在微生物检验操作过程中，每一个环节都很重要，稍有疏忽就会影响结果的准确性。因此，临床微生物检验人员要求接受继续教育，接受新的专业理论，学习新的专业技术，要具备全面的理论知识、熟练的操作能力和丰富的临床经验；做好室间质量评价活动不是目的，是通过这种方式了解日常工作中可能存在的问题，持续改进，更好的为临床服务。
（责任编辑：lgh）
