一、分子杂交的概念:
分子杂交(molecular hypidization)指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理,形成异质双链的过程。
利用这一原理,就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针,去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。
二、分子杂交基本原理:
(一)DNA变性 :
DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成单链无规则线团,因而发生性质改变(如粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加等) 。
1、DNA变性的方法:
1)加热;
2)改变DNA溶液的pH;
3)有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。
2、增色效应:DNA在260nm处有最大吸收值,这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧,变性时由于双螺旋解开,于是碱基外露,260nm紫外吸收值因而增加,这一现象称为增色效应(hyperchromic effect) 。利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。
3、溶解曲线:如果升高温度使DNA变性,以温度对紫外吸收作图,可得到一条曲线,称为溶解曲线。
4、融解温度:通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(即熔解曲线中点对应的温度),由于这一现象和结晶的融解相类似,故又称融点或融解温度(melting temperature, Tm)。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。
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