核酸提取加蛋白酶K有什么好处？遇“复杂样本”更显身手

作者 | 李偲单位 | 重庆医科大学附属第一医院第一分院呼吸科01概述随着新冠疫情的发展，新冠病毒核酸的检测工作已趋于常态化。而优质的核酸提取试剂是核酸检测的基础，正确提取核酸才能保证下游检测结果的质量。市场上核酸提取的试剂成分虽然各有差别，但蛋白酶K由于其独特的广谱蛋白水解酶活性和稳定性，目前已成为了多种提取试剂的重要原料。另外，在临床实践中，特别是我国目前正在推行20混1检测的场景下，难免会遇到复杂样本（例如含有“痰液”的样本）；而蛋白酶K在处理特殊样本时，更能突显出作用。02蛋白酶K广泛应用于核酸提取蛋白酶K来源于林伯氏白色念球菌，是一种丝氨酸蛋白酶，具有较强的稳定性和广谱蛋白水解酶活性，目前广泛应用于核酸提取中[1]。01【广谱蛋白水解酶活性】蛋白酶K可作用于多种蛋白，在病毒核酸提取检测中发挥多重作用：（1）裂解病毒的外壳蛋白，暴露核酸分子，并且病毒外壳蛋白失活可进一步保证运输和检测阶段更安全；（2）降解与核酸紧密结合的组蛋白，使得核酸游离到提取液中，有利于进一步纯化；（3）降解RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸检测。02【稳定性】蛋白酶K能在多种环境[pH（4-12.5），高盐缓冲液，70℃的高温等]中保持活性。另外，蛋白酶K的活性不受SDS、尿素、EDTA、盐酸胍、异硫氰酸胍等的抑制，且一定含量的去垢剂还可以增强蛋白酶K的活性。03蛋白酶K在新冠指南、政策文件均有推荐学术指南和政策文件中，均提及蛋白酶K的应用。早在2020年4月疫情暴发伊始，中华医学杂志发布了《2019新型冠状病毒核酸检测专家共识》，提出收集痰液于采样杯中，采样杯里需装入2mL蛋白酶K（1g/L）[2]。2020年7月13日，国务院发布了《医疗机构新冠病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》，文中指出，如果痰液未收集于采样液中，可在检测前，加入2～3mL采样液，或加入与痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化[3]。2021年5月，国家卫生健康委员会发布《新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）》，文中提及处理痰液样本时，可采用痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。04相关研究提示蛋白酶K对复杂样本核酸提取具有重要作用新冠的核酸采样主要采集口咽拭子和鼻咽拭子样本，但在临床实际工作中，难免会采集到一些复杂样本，例如：痰液等。《2019新型冠状病毒核酸检测专家共识》中引用的研究[4]提示，在复杂样本的提取核酸，使用蛋白酶K效果更佳。在该研究试验中，SungH等[4]采用了蛋白酶K和其他两种方法，提取痰液标本中的核酸（RNA），并使用荧光PCR仪对三种方法提取的核酸进行分析比较。试验显示，另外两种方法提取核酸检测结果中，假阴性率分别为16.7%和13.3%；使用了蛋白酶K处理的样本，检测结果并无假阴性。另外，蛋白酶K组PCR检测的Ct值范围在31.1-35.4之间，而另外两种方法学PCR检测的Ct值范围分别为34.7-39.0和33.9-38.6。另外，Saber Khelaifia等对粪便标本中的细菌DNA进行提取，结果显示使用蛋白酶K可以提高DNA的提取量[5]。Tomoo Jikuzono使用蛋白酶K对液基细胞溶液固定的甲状腺细胞进行处理后，提高了RNA回收率[6]。蛋白酶K增加核酸提取量可能的原因为：（1）复杂样本（如：痰液样本）中存在着一些可PCR反应的物质（可抑制PCR的物质，例如糖蛋白，免疫球蛋白等物质就是PCR的抑制物），使用了蛋白酶K可最大程度清除该类物质，保证PCR结果准确性；（2）复杂样本的核酸提取过程中，易残留较多RNA酶，使用蛋白酶K可最大程度灭活RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸检测。也有一些研究提示，蛋白酶K在复杂样本的处理中并未显示突出作用[7]。这可能与使用的蛋白酶K活性不同有关，另一种可能是与使用场景有关，蛋白酶K加入裂解液之中，若作者长时间放置，蛋白酶K会失活，此时就会得到加不加蛋白酶K没有作用的结论），未来仍需大量研究进一步探索。目前，新冠疫情依然在全球肆虐，核酸提取检测已趋于常态化。在临床实践中，特别是“10混1”或“20混1”检测的场景下，难免会遇到复杂样本（例如含有“痰液”的样本）；而蛋白酶K在处理特殊样本具有独特作用。未来我们需进一步深挖多种提取检测使用场景，探索最佳使用方案，以期更好的控制疫情。参考文献[1]刘杨柳，武小芳，胡树样，等.蛋白酶K的性质及其在核酸提取中的应用[J].食品研究与开发.2017, 38(10): 196-199.[2]2019新型冠状病毒核酸检测专家共识[J].中华医学杂志.2020(13): 968-969.[3]关于印发医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）的通知[4]Sung H, Yong D, Ki C, et al. ComparativeEvaluation of Three Homogenization Methods for Isolating Middle EastRespiratory Syndrome Coronavirus Nucleic Acids From Sputum Samplesfor Real-Time Reverse Transcription PCR[J]. Annals of LaboratoryMedicine. 2016, 36(5): 457-462.[5]Khelaifia S, Ramonet P, Bedotto Buffet M, et al.A semi-automated protocol for Archaea DNA extraction from stools[J].BMC research notes. 2013, 6(1): 186.[6]Jikuzono T, Horikawa A, Ishikawa T, et al.Proteinase K treatment improves RNA recovery from thyroid cells fixedwith liquid-based cytology solution[J]. BMC Research Notes. 2018,11(1).[7] Goldschmidt P, Degorge S, Merabet L, et al. Enzymatic treatmentof specimens before DNA extraction directly influences moleculardetection of infectious agents[J]. PLoS One. 2014, 9(6): e94886.END
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