淋球菌实验室诊断之所见

作者 | 马晓云单位 | 同济大学附属东方医院胶州医院检验科前  言淋病虽然是一类比较古老的性传播疾病，但在人类长期发展历程中它早已产生了一种可以逃避人类自身免疫系统的机制，最新世界卫生组织（WHO）数据显示以淋病、衣原体和滴虫病等为首的性传播疾病全球每天新增约100万例以上。是全球需要共同关注的公卫问题，也是我国重点防控的传染性疾病。病毒不断变异的时代，早期诊断是控制传播的关键。哪种情况下选择合适的淋球菌检测方式比较恰当呢？案例经过门诊男性患者，26岁，因“尿频尿急尿痛”就诊我院泌尿外科，门诊送检尿常规检验，仪器检测提示：白细胞952/uL↑，红细胞镜检126/uL↑，白细胞酯酶2+↑，细菌计数283.3/uL↑。手工尿沉渣涂片镜检见大量白细胞多形状不完整，红细胞大小形态均一，患者门诊取检验报告时，神情紧张于采血窗口询问工作人员尿常规检查结果中带箭头项目，尤其细菌计数代表的意义。在与患者交流沟通过程中，了解到患者因怕隐私暴露就诊时曾向临床医师故意隐瞒病史，结合患者当前结果及自述症状，考虑患者细菌性尿路感染很有可能为淋球菌感染引起，于是联系临床建议该患者送检尿道分泌物涂片及淋球菌培养查找革兰阴性双球菌。虽然送检涂片分泌物量较少，但革兰染色后油镜下部分白细胞浆内及破碎细胞质外找到典型双肾样革兰阴性双球菌（见图1）。图1 
10×100倍革兰染色案例分析此份病例中，患者男性，曾于一周前生殖器开始出现脓性分泌物，由于其自行口服抗炎药症状稍缓解，结合尿常规异常结果与尿频尿急尿痛等临床症状符合急性尿道炎表现。通常在淋球菌实验室检测方法中，显微镜检查法直接涂片革兰染色对泌尿生殖道感染患者特异性好、敏感性高，尤其男性有尿道症状患者显微镜检查特异性可达97%、敏感性95％，而该患者由于分泌物标本采集量较少，且取样和送检要求均不利于其分离培养法检测，但根据显微镜检查法在有尿道炎症状男性分泌物检测中特异性与敏感性高的特点，该患者油镜下发现黏膜上皮细胞、白细胞内外胞浆均有典型革兰阴性双球菌，亦可明确诊断。大大缩短诊断时间，节约检测成本。实验室诊断淋球菌感染实验室诊断主要对感染性黏膜分泌物中淋病奈瑟菌进行鉴定。传统常用淋球菌感染实验室病原学检测方法为显微镜检查法及培养法，近年核酸检测以及质谱检测技术随着分子生物学诊断的发展逐渐成为指南推荐的实验室检测方法之一。通常女性取阴道分泌物（子宫切除的女性也取尿道分泌物），男性取尿道分泌物。当有症状时，喉咽部也可取分泌物。核酸扩增法也可使用阴道拭子或者尿标本。条件允许的情况下，肛门直肠样品应通过肛门镜检查直接获得。1传统方法显微镜检查法：01标本要求泌尿生殖道、子宫颈、结膜等分泌物标本直接涂玻片送检，对标本送检过程的温湿度及保存无特殊要求。02操作要求（1）戴消毒手套后，接种环或棉拭子蘸取泌尿生殖道、子宫颈、结膜等处脓性分泌物，轻涂于玻片上，待其自然干燥后做快速革兰染色并镜检。（2）黏膜上皮细胞、白细胞内外找到革兰阴性肾形双球菌时，可明确诊断。03优势（1）显微镜检查法对泌尿生殖道感染患者特异性好、敏感性高，尤其男性有尿道症状患者显微镜检查特异性可达97%、敏感性95％，能快速明确诊断。（2）标本取材方便，操作快捷。（3）检测时间短，检测费用低。04缺点（1）泌尿生殖道外感染淋球菌与同奈瑟菌属其他共生菌形态相似，直接镜检特异性较低。（2）对人员形态识别能力有要求。分离培养：01标本要求（1）采集泌尿生殖道分泌物、泌尿生殖道外黏膜、脓肿处拭子、尿液标本。（2）对病原体的存活状态有特定要求，培养法标本运送过程需注意保温保湿，即刻送检，或培养基接种后送检培养。02操作要求（1）取材①男性尿道取材可用细小棉拭子于尿道2～4cm处轻轻蘸取略带黏膜分泌物。②女性患者取材时，用两只无菌棉拭子分别蘸取其表面及宫颈口内1～2cm处分泌物。③直肠取材时，棉拭子应插入肛门2～3cm。④淋球菌性咽炎时，应从扁桃体和扁桃体窝取材。⑤对青春期前女童可采集阴道处分泌物标本。（2）培养基要求密封4℃保存，贮藏时间不宜超过3周，培养温度36℃左右，相对湿度80%以上，初次培养达到5%～10%CO2环境。培养24-48h看结果。如培养结果阳性需做菌落鉴定。（3）初步鉴定菌落形态特征：圆形、凸起、润泽、黏性感、光滑、半透明至灰白色菌落。24h多黏菌素B血液琼脂上或巧克力培养基菌落大小0.5-1mm，48h后2-3mm大小，菌落边缘平滑或菜花状，表面粗糙。（4）培养后分离菌株革兰染色：观看染色后形态特征。（5）氧化酶试验：配置0.5%～1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，滴加于可疑菌落上，以观测其色泽改变。当接触氧化酶试剂15~20s菌落产生红色，并持续30s以上，再慢慢转为紫色，最后呈现黑色，则为氧化酶试剂阳性，可证实是淋球菌，但非特异性。（6）糖发酵试验：普通淋球菌只能降解葡萄糖，而不能分解麦芽糖、蔗糖、乳糖等其他糖类，而脑膜炎奈瑟菌却能降解葡萄糖和麦芽糖，可以此和其他奈瑟菌进行鉴别。（7）用全自动细菌鉴定仪进行进一步鉴定。（8）鉴定结果阳性的分离株常用纸片扩散法、琼脂稀释法和E-test法等药敏实验方法进行药物敏感性实验。03优势（1）对及时送检女性患者，尤其淋病盆腔脓肿、无症状感染者标本有较好的敏感性。（2）可与同奈瑟菌属其他共生菌进行鉴别。（3）提供药敏试验结果，直接干预临床治疗。04缺点（1）培养法敏感性受标本淋球菌活性状态、取材部位、送检时间影响。（2）培养法检测时间长。传统方法检测注意事项1.分泌物涂片时要
注意涂擦厚薄合适，不应用力以免细胞破裂变形。2.女性宫颈分泌物、咽和直肠标本在涂片中由于杂菌较多，故推荐用培养法。3.尿道或宫颈分离培养取材时，拭子伸入要有足够深度。4.淋球菌培养取材后应立即接种，标本离体的时间越短越好。5.分离培养应采用加抗生素的选择性培养基。6.氧化酶试剂应保证新鲜配制，并在棕色瓶中避光保存。7.接种环应为非铁丝所制，避免受氧化酶试剂因遇铁变红的干扰。8.对症状不典型的男性患者，最好在其晨起排尿前或排尿4h以后取材。2分子生物学方法核酸检测01标本要求采集多种泌尿生殖道及非侵入性标本检测。男性易送检晨尿、女性易送检阴道拭子。不受标本淋球菌活性状态影响，标本保存、转运条件要求低。02操作要求核酸杂交试验不扩增目的基因，而是利用标记的DNA探针识别细菌的特定核酸序列进行淋球菌鉴定。核酸扩增试验（NAATs）是通过扩增淋球菌特异性基因片段检测淋球菌。方法包括实时荧光PCR、转录介导扩增技术（TMA）、链置换扩增（SDA）和床旁检测技术（POCT）。目前国内主要采用PCR荧光探针法、荧光PCR和RNA恒温扩增法。03优势（1）具有较好敏感性和特异性，尤其对口咽、直肠等泌尿生殖道外标本的敏感性明显高于培养。（2）速快检测送检标本中极微量病原体。（3）检测结果不受淋球菌活性影响。04缺点（1）仪器设备、试剂相对昂贵，检测费用较高。实验准确性受实验室质量控制（阳阴性质控、环境质控）、其他奈瑟菌污染和参数设置等因素影响，存在一定的假阳性率。（2）无法进行抗菌药物敏感性试验。质谱检测01标本要求采用临床标本培养分离株进行淋球菌鉴定。02操作要求主要采用MALDI-TOF
MS软电离质谱将微生物自身独特的核糖体蛋白，又称指纹蛋白转化为可以在仪器中运动的带电气态离子，并在磁场中根据其分子碎片、分子、离子得的何比大小来记录和形成排列图谱。通过比对MALDI-TOF
MS特异峰图与数据库中的指纹蛋白参考谱图，分析并给出最接近菌种的相应鉴定分值，得到最终结果。  质谱主要构成及工作原理03优势（1）对单个反应成本较低、操作简便。（2）病原微生物鉴定领域具有高灵敏度、准确度、分辨率。（3）分析快速几分钟出结果，可以缩短细菌鉴定时间24-36h左右。04缺点（1）该检测针对培养后的菌落进行鉴定，准确性受数据库内菌种信息量和可靠性影响，需不断完善其数据库信息，合并临床评估其准确性。（2）我国质谱技术应用处于初级阶段，需加强标准化操作及临床应用的推广。诊断与鉴别诊断淋球菌感染主要通过性接触、类似性行为及间接接触引起尿道、宫颈及生殖器以外如咽喉、结膜、关节、直肠和骨盆内等全身各处传染。淋球菌可侵犯全身黏膜，尤其是对黏膜单层柱状上皮和移行上皮细胞都有着很强侵袭能力，急性期可在尿道炎与阴道炎脓性分泌物的白细胞中发现致病菌。有20%的男性和60%的女性患者可呈无症状感染。感染后3-5天即可发病。男性易引起尿道炎，造成尿频、尿急、排尿困难、脓性分泌物、腹股沟淋巴结炎，还可合并前列腺炎、精囊炎、附睾炎。女性易引起宫颈炎、阴道炎也可合并子宫内膜炎、盆腔炎、不孕不育、异位妊娠等。男女皆可引起淋菌性肛门直肠炎、咽炎、结膜炎等，增加感染HIV的机会。诊断要点：主要根据病史（有可疑的性病接触史及其他直接或间接接触患者分泌物史）、典型临床表现和实验室检查结果进行诊断。鉴别要点：淋球菌感染应与生殖道衣原体感染、念珠菌性阴道炎及滴虫性阴道炎等进行鉴别。生殖道衣原体感染临床表现较轻，淋球菌检查阴性；需注意的是临床上二者常并存，导致患者迁延不愈。播散性淋球菌感染诊断主要根据临床表现和血液、关节液、皮损等处的淋球菌培养结果。判愈标准：治疗结束后2周时间，无性接触史情况下，全部症状和体征消失；治疗结束后4-7天做淋球菌涂片和培养阴性或核酸检测结果阴性视为痊愈。案例总结对不同的人群、不同的感染部位，一般应选择敏感性及特异性均较高的检测方法。对有症状尿道感染者，尤其是男性尿道炎患者敏感性和特异性接近100%，首推显微镜检查法。细菌培养技术成熟，对立即采集检验的标本敏感性和特异性相对较高，同时可进行药敏试验，直接指导临床用药，所以仍是目前所提倡的“金标准”。分子生物学检测淋球菌特异性基因片段灵敏度高、特异性强，可定性检测适用于无症状感染患者，疾病治疗恢复期、流行病学调查。专家点评李玉杰主任技师
同济大学东方医院胶州医院检验科主任该案例反映的是检验医师不但要熟悉检验项目的敏感性、特异性，还需要了解相关临床疾病及检验结果临床意义，并及时为医生和患者解释。本案例也说明医学检验向检验医学发展，有利于更好地服务临床，融洽医患关系。参考文献[1]张伟，刘坤，王希良.淋球菌致病机制的研究进展[J]微生物学免疫学进展，2009,37（4）；46-49[2]郑晓丽，陈绍椿，尹跃平.淋病奈瑟菌实验室检测技术进展[J]临床检验杂志，2020,38(67)；447-449[3]周龙荣，徐元宏.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF
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