PCR是一种模拟天然DNA复制过程，在体外将特异性目的DNA片段序列进行高效扩增的分子生物学新技术。自八十年代由美国Muilis发明这项技术以来，由于具有快速、敏感、特异及高效的特点，得以迅速推广，并从这一分子生物学基本技术扩展出一系列分子生物学研究方法。PCR扩增所需的模板DNA来源，也由从新鲜组织细胞、冰冻组织中提取到可从石蜡包埋组织中获得。
一、石蜡包埋组织PCR的意义： 1、对疑难病例的诊断和鉴别诊断： 由于PCR检测的高敏感性和高特异性，如用于IgH/TCR基因重排时敏感 性达10-4 ～10-6 ，一些衍生的PCR方法还可进一步提高敏感性，因此，是提高诊断率的一个重要辅助手段。 2、 结束了DNA研究依赖于新鲜、冰冻组织和细胞的历史，可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要。 3、 用于回顾性研究：大量存档的石蜡包埋组织可充分利用，对肿瘤发生的分子机制进行探讨。 4、对疾病的形态学、免疫表型和基因改变作相关性分析。
二、PCR对石蜡包埋组织的要求： 组织固定和石蜡包埋制片过程与免疫组化要求基本相同，但需注意： 1、含血多的组织先用生理盐水洗后再固定。 2、坏死组织必须去除。 3、甲醛固定时间越长对DNA破坏越严重，因此固定时间最好不超过24小时。 4、避免交叉污染，组织切片放入无菌AP管或捞于干净的载玻片上。 5、切片应具有一定的厚度，一般约5-10微米。
三、石蜡包埋组织DNA的提取方法： 1、酚抽提法： 酚抽提法是DNA的常规提取方法，比较稳定。a石蜡包埋组织切片（5-7微米）1-5片放入1.5毫升无菌AP管中。 b、加二甲苯1毫升脱蜡10分，离心10000r/5分，弃上清，重复二次。 c、加无水乙醇1毫升洗二甲苯5分，离心6000r/5分，弃上清，重复二次。d 、将AP管盖打开，放入37℃恆温箱内干燥组织0.5小时，取出放室温，使乙醇尽量挥发。e 、加消化液0.5毫升混匀，37～50℃水浴消化过夜，至组织完全消化为止。 PH8.0 10mM Tris-HCL Buffer 1mM EDTA 消化液成分： 10%SDS 终浓度25微克/毫升 20mg/ml PK 终浓度500微克/毫升 f 、组织消化后取出AP管，离心12000r/10分，小心吸出上清（DNA）于另一AP管内，弃沉淀。 g 、在上清内加1倍体积饱和酚轻轻颠倒混匀，离心6000r/5分，此时液体分为三层，从上至下为：上清（DNA）–蛋白质–酚，小心吸出上清至另一AP 管中。 h 、加1倍体积酚/氯仿（1：1）混合液，轻轻颠倒混匀，离心6000r/5分，此时管内液体分为两层，上清（DNA），下层有机试剂（细胞密度大，蛋白质含量丰富的组织，有时中间层也出现少量的蛋白质），小心吸出上清至另一AP管中。 i 、 加1倍体积氯仿/异戊醇（24：1）混合液，轻轻颠倒混匀，离心6000r/5分,此时管内液体分为两层，上清（DNA），下层有机试剂，小心吸出上清液至另一AP管中。 j 、 DNA沉淀：加1/10体积的PH5.2、3M/L NaAC缓冲液，混匀，再加2倍体积-20℃预冷无水乙醇，混匀后放-20 ℃2小时以上或过夜。 k、 离心12000r/15分，弃上清，管内沉淀即为DNA。 L、 加1倍体积75%乙醇洗沉淀，室温放5分，离心12000r/15分，弃上清，沉淀室温自然晾干。 m、 加无菌去离子水（或TE液）适量溶解DNA，放4 ℃冰箱保存待用。 2、粗提法：（粗提+刮片法） a、石蜡包埋组织切片（5～7微米）1～5片，贴于干净的载玻片上，烤干。 b、二甲苯脱蜡10分× 3次。 c、无水乙醇洗二甲苯5分× 3次，切片自然干燥。 d 、 用无菌刀片，将脱蜡后的组织从玻片上刮下，收集于无菌AP管中。 e、加消化液0.1ml，轻轻混匀，在37～50℃水浴中消化过夜。 PH8.0 50mM Tris-Hcl Buffer 消化液成分： 10mM EDTA 0.5%（V/V) Tween-20 100- 200微克 PK f 、 待组织完全消化后，将AP管移入沸水中煮10分，灭活蛋白酶K的活性。 g、 离心10000r/10分，取上清即为DNA模板，放4℃冰箱备用。
两种提取方法的比较： 酚抽提法： 有机试剂的多次抽提，可消除石蜡包埋组织因固定所造成的理化性质的改变。亦可消除一些DNA聚合酶的抑制因素，故DNA纯度较高、稳定、重复性好，适用范围广。不足之处是步骤较多，DNA丢失严重，不适于少量标本的DNA提取。 粗提与刮片法： 快速，省去了多次离心的繁杂步骤，减少了DNA的丢失。不仅适用于未染色的组织切片，而且还适用于经HE、免疫组化染色的组织切片。最突出的优点是可在光镜下选择性刮取所需组织，去除抑制PCR反应的出血、坏死等组织，提高阳性检出率，为临床基因检测和科研工作 密切结合及同步观察提供了一个较为实用的方法。适用于少量标本的DNA提取。不足之处是产品较粗，重复性较差，不适于对DNA质量要求高的检测技术（如DNA测序）。 选择何种方法提取DNA，主要看实验的目的。PCR扩增对DNA模板要求不高，粗品也能扩增产生大量特异性DNA拷贝。但是为了提高PCR敏感性和可重复性，模板DNA尽可能地纯化，除去提取物中某些抑制PCR反应的成分。 四、DNA纯度的测定： 1、分光光度法测定DNA含量： 利用分光光度法测定DNA中碱基吸收紫外辐射的量。DNA最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm。根据260/280的读数比值估计DNA的纯度。260/280比值在1. 60-1. 80之间较好，比值过高（ 1.85）可能有RNA污染，比值过低（1.60）可能有蛋白质污染。一个OD值相当于大约50μg/ml双链DNA。 2、溴化乙啶（EB）荧光法： DNA含量 ＜250ng/ml或DNA样品中杂质含量较高时用。EB可嵌入DNA 分子，在紫外光下产生荧光，荧光强度与DNA含量成正比，以此估计DNA含量。 五、提高DNA质量的方法： 1、组织的固定和包埋：10%中性甲醛固定时间不应太长，一般在12-24小时之内，包埋过程避免温度过高，大约62 ℃左右。 2、石蜡包埋组织块的选择：石蜡切片结构不清，有大片出血的蜡块不用；有明显坏死存在的蜡块最好不用，或切去坏死部分再用；尽可能选用近期的蜡块。 3、改善提取方法：需要根据组织类型调整消化液中各组分的浓度和消化时间。 4、避免DNA机械损伤：切片不能太薄，操作过程要轻，避免过多移管，以防人为的DNA剪切。 六、DNA的儲存： 提取或纯化的DNA，最好用TE buffer溶解（也可用无菌去离子水溶解），4 ℃ 保存待用。短期内不用可放-20℃冻存，DNA溶液可保存6个月，冻干后保存期1-2年，-70 ℃能保存5年以上。长期保存时，可在DNA样品中加入1滴 氯仿避免细菌和/或核酸酶的污染。切忌反复冻融，以免DNA降解。 七、PCR原理及步骤： 聚合酶链反应是基于体外模拟DNA的天然复制过程，在有模板DNA、引物 和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。 原理： 靶序列 ————————————– DNA模板 ————————————–
————————————– 变性 在高温下，待扩增的靶DNA双链受热变性，磷酸二酯键断裂成两条单链DNA ———————-
———————- 退火 在低温（45-67 C）下，两条人工 合成的寡核苷酸引物与互补的单链 DNA模板结合，形成部分双链 ————————
———————– 延伸 在TaqDNA聚合酶催化下，以 引物3端为合成起点，以单核 苷酸为原料，沿模板5，→3， ————————————- 方向延伸合成DNA新链。 一个PCR循环
每一个循环产生的DNA均为下次循环的模板，经25～35个循环后，理论上可使基因扩增109 倍以上，实际106 ～107倍。 以PCR检测免疫球蛋白重链（IgH）和T细胞受体（TCR）基因重排为例，简述PCR扩增过程。 原理： 淋巴细胞在分化发育过程中，TCR和IgH编码基因发生重排，即可变区（V）与结合区（J）之间两个距离很远的片段重新排列在一起，形成新片段。这些新片段是每个淋巴细胞克隆特有的标记。用V区相对保守的寡核苷酸序列作引物一端，J区的一段序列作引物另一端进行PCR扩增，结果：正常淋巴细胞的重排过程具有随机性和多态性，扩增后产物电泳图像呈弥漫分布，无明显重排带；而淋巴系统恶性肿瘤由于某一阶段发生突变呈克隆性增殖的瘤细胞为同一基因结构，形成单克隆性重排，扩增后产物电泳呈一狭窄的重排带，这 就成为淋巴系统疾病基因诊断的分子生物学基础。
1、PCR反应体系（25微升体积）：
100mM/L Tris-HCl PH8.0 15mM/L KCl PCR buffer 15mM/L MgCl 0.01% (w/v) 明胶 dNTP (1mM/L) 引物 （20μM/L） Taq DNA 聚合酶 （ 2u/μl ） 模板DNA ( 50ng～1μg) 无菌去离子水 （补足体积） 2、PCR反应条件： IgH：采用一对半（三条）引物两轮扩增，也称半巢式扩增。 第一轮引物： FR2 A、 LJH 或 FR3 A、 LJH 循环参数： 预变性 95 ℃ 3分 变性 94 ℃ 40秒 退火 62 ℃ 50秒 延伸 72 ℃ 40秒 30个循环 第二轮： 将第一轮产物以1：50–1：1000无菌去离子水稀释后作模板。引物： FR 2A、 VLJH 或 FR 3A、 VLJH 循环参数： 变性 94 ℃ 40秒 退火 60℃50秒 延伸 72 ℃40秒 25个循环后，再延伸72 ℃10分。
TCRγ：采用8条引物混合单轮扩增。 引物： V2、V3、V4、V8、V9、JGT12、JGT3、JGT4 循环参数： 预变性 94℃ 6分 变性 94 ℃ 1分 退火 55 ℃ 1分 延伸 72℃ 1分 40个循环后，再延伸72 ℃10分。 八、PCR扩增中须注意的问题： 1、设相应的对照： 阳性对照：瘤细胞株或已知有单克隆性重排的淋巴瘤。 阴性对照：淋巴结反应性增生或无模板的DNA扩增产物。 2、注意PCR扩增过程中的污染： 器皿和试剂经高压消毒，试剂小量分装，操作时戴手套，最好在超净台内工作。 3、Taq DNA聚合酶虽具耐热性，但长时间高温也会使酶活力下降，应尽量减少高温加热时间。 4、Taq酶对Mg2+ 十分敏感，是Mg2+ 的依赖酶。反应体系中dNTP、引物、模板DNA及buffer中的EDTA均能与Mg2+ 结合，影响自由Mg2+浓度。反应体系中这些试剂的用量，尤其是模板DNA用量，要保持相对恒定。 5、PCR是一个复杂的体系，许多组分和条件互相制约，改变某一条件会涉及其它因素，无统一标准的最佳条件。应在通用条件基础上，通过实验适当调整，以确定自己的最适条件。 九、PCR扩增产物的分析： PCR扩增产物的长度由引物间距离决定。产物长度不同，电泳过程中泳动速度不同，将其与标准DNA Marker对照，就能确定出产物的bp大小。 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳： 浓度视待分析产物bp大小而定，EB（溴化乙啶）染色，紫外透射仪下观察特定区域条带。也可用银染色，肉眼观察结果。此法敏感性高，主要用于5～500bp的小片段产物。 2、琼脂糖凝胶电泳： 视待测产物bp大小而定，EB染色，紫外透射仪下观察特定区域条带。 此法敏感性稍低，主要用于200bp～50kb的大片段产物。 阳性标准：a、阳性、阴性对照结果正常。 b、电泳条带清晰，宽度在2mm以内。 c、片段大小与引物特定的范围相符。 d、特异性阳性条带亮度大于非特异性带。 十、常用试剂的配制： 1、20mg/ml 蛋白酶K （PK）： 称20mg PK，无菌去离子水1ml溶解，分装，-20 ℃冻存。 2、PH8.0 TE液： 储存液： 1M Tris-HCl： 称Tris-碱12.1g，溶于去离子水，浓盐酸调PH至 8.0, 定溶100ml，高压灭菌。0. 5M EDTA：称乙二胺四乙酸二钠18.6g，溶于去离子水，10N NaOH调PH至8.0，定容100ml ，高压灭菌。 应用液： A： PH8.0 0.01M TE 1M Tris-HCl 1ml. 0.5M EDTA 0.2ml.加去离子水98.8 ml混匀，高压灭菌。 B： PH8.0 0.05M TE 1M Tris-HCl 5ml. 0.5M EDTA 2ml. 吐温-20 0.5ml，加无菌去离子水92.5 ml 混匀，高压灭菌。 3 、 PH5.2 3M/L NaAC buffer： 称NaAC.3H2 O 40.8g去离子水溶解， HAC调节PH至5.2，定容 100ml，高压灭菌。 4、10%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）： 称SDS 1g，加无菌去离子水溶解，定容10ml，4 ℃储存。 十一、石蜡包埋组织PCR扩增中存在的问题： 1、引物设计不够广谱，存在假阴性，或/和操作环节不当及其它原因所致的假阳性。 2、结果判定无统一标准。 3、由于影响因素较多，DNA模板质量不稳定，重复性较差。 4、操作和试剂无标准化，设备条件要求高，技术难度也较大。 5、PCR反应受抑制物影响，成功率还有待提高。 十二、石蜡包埋组织PCR检测的应用： 1、淋巴系统良恶性疾病的诊断和鉴别诊断。 包括恶性淋巴瘤与淋巴组织反应性增生的鉴别；淋巴系统恶性肿瘤的分型；淋巴瘤的骨髓转移等。 2、血液系统其它恶性疾病的基因检测。 3、微小残留病变的监测。 目前微小残留病（MRD）的检测主要有3种方式：荧光原位杂交（FISH）；多聚酶链反应(PCR)和流式细胞术（FACS）。FISH检测残留白血病细胞某些特殊的染色体异位；RT-PCR检测易位后形成的嵌合基因；PCR检测MRD细胞的Ig/TCR基因重排；FACS检测MRD细胞特有的分化抗原。 4、白血病耐药基因的研究。 5、分析癌基因和抗癌基因。
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聚合酶链反应（PCR）在石蜡包埋组织中的应用
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