宁永忠 北京大学第三医院
按：枠，音桦（四声），是日本汉字。本义：框架、圈子、范围、限度。看平皿生长，需要确定哪个菌鉴定、哪个不鉴定，正好契合该字含义。花絮：开京港会，在旁边万达广场一楼看见一个眼镜店。品牌是“枠”。饶是学生我饱（chun）读（cui）诗（pian）书（ren），也不认识啊！( ⊙ o ⊙ )啊！赶紧恶补！正好用在看碟子这里！(*^__^*) 嘻嘻……
微生物学组的常规工作要看培养基生长情况。英语临床微生物学领域对此有一个名称，叫平皿阅读（plate reading）[1]——就是对平皿生长的解释。这是临床细菌学、真菌学的基础工作，天天都在进行。阅读平皿是一个承前启后的过程，前面是标本，后面是进一步检测、报告，彼此钩挂连横，需要通盘考量，反馈调整。
一、阅读平皿的前提
前提是标本和临床信息。所以在阅读之前，要核对二者。包括：姓名等个体信息、年龄性别、病房、诊断、抗生素使用、标本六点。标本本身最重要。
1．姓名、病历号等：这些是患者的个体信息。细菌学真菌学工作与检验医学其他分支的不同之一是，要记忆人名。通过记忆人名来记忆之前患者的细菌学真菌学信息。当然完全记住很难。有个大致的印象即可。现在HIS和LIS很发达，有了大致印象，在信息系统找到精确对应。由此同一患者同一标本近期的涂片、生长关联标本的信息等，乃至临床信息和其他实验室信息都会一目了然。
2．年龄性别：这是患者与疾病相关联的自然生物属性。和感染有一定关联。儿科、妇产科的病原谱、感染特征同其他情况各不相同，看平皿前需要有所了解。
3．病房也很重要。比如ICU病房，它是患者疾病严重程度的一个标志。门诊、入住普通病房、入住ICU是疾病严重程度的简单分层。很多分离株的处置，对ICU和非ICU是不同的。
4．诊断：这是关键信息。检查单/LIS中必须有诊断。没有的话可以通过医务处、信息中心进行解决。诊断栏目有信息时，要区分感染性疾病诊断和非感染性疾病诊断。比如尿液培养，如果诊断写尿路出血、尿异常等，这在严格意义上，是不合适的。接标本环节应该厘清。再如咳痰标本，如果诊断是肺炎、AECOPD、AECB、CF、支扩感染等感染相关诊断，则正确。其他诊断则没有咳痰培养的适应征，接标本环节同样应该厘清。比如实际工作我们遇到过心肌梗塞、心功能衰竭等。
5．抗生素使用：检查申请单必须有抗生素信息。是否使用，化学通用名称等。使用抗生素时，阳性率会下降，相应平皿阅读的判断标准也应该有所调整。
6．标本：首先明确标本的性质、看标本接收处置环节是否存在错误。标本性质是最关键信息，要和诊断相呼应。而上游标本处置环节如果有错误，要及时反馈调整。比如是否没有接种合适的平皿，接种方式是否正确，放置培养箱是否正确，不同操作人员是否统一，编号是否错误，培养基和检查申请单的对应是否有误等。之后按不同标本各自的流程，进行平皿阅读。比如肺组织需要研磨（怀疑毛霉不能研磨，需要剪开）定量培养、BALF需要离心或不离心后定量培养、咳痰需要质量判断合格后半定量培养、血直接注入血培养瓶上机、清洁中段尿液不离心定量培养等。
二、平皿阅读
广义平皿阅读分三步：首先是生长记录，然后是鉴定思路，最后是结果记录和分析[2]。
1．生长记录：培养时间、不同特征菌落的量和特征描述。
1.1 培养时间要记录，尤其对于血培养、真菌培养、厌氧菌培养等。血培养的培养时间和阳性报警时间紧密相联，要非常明确，并分别记录。何时报警，何时涂片报告，何时传代，传代后24hr生长如何等，要一一记录。真菌培养的特点是周期长，24－48hr看一次平皿。如果不记录时间，则生长信息会交叉混乱。厌氧菌类似。厌氧菌培养是国内细菌室的短板。很多实验室名义上可以做厌氧菌培养，实际能力差强人意。通过检查单记录、平皿阅读即可见一斑。
需要注意的是时间的完整性。比如咳痰培养，24hr见到肺炎克雷伯菌，进行后续处理。原始平皿72hr是否需要再看？这是实际工作的盲区。理论上讲需要再看，实际上耗时很多，难以落实。
另外需要注意的是，是否有来自医生的特殊要求。比如咳痰，如果医生注明关注奴卡菌，则培养时间要延长到至少1周。
1.2 菌落特征：这是临床细菌学、真菌学平皿阅读的关键。对菌落有超过10个以上的角度进行衡量，诸如大小、边缘、颜色、凹凸扁平、表明光滑粗糙、透明度、溶血、气味、干湿、移动等，阅读者要在阅读之前，对常见菌种和关注菌种应有所了解[3]。注意区分假菌落（精液/积液的油滴、标本中的蛋白或黏液颗粒、培养基表面凹坑、划线时划起的琼脂碎屑等）。
1.3 量：首先要明确是否需要定量，是半定量还是定量。血培养传代后，不需要定量（量是对原始标本微生物浓度的记录，血培养传代后培养，生长量与原始标本无关）。血管内插管、支气管肺泡灌洗液BALF、尿液标本需要定量。组织标本国际上是称重定量，国内一般做不到。其他标本需要半定量。三区划线、密涂的目的之一就是判断生长量。如果标本处置环节没有按相应标本要求进行接种，则需要反馈调整。比如尿液标本，应该定量，而进行了半定量，则是错误。定量、半定量的规则见相关书籍。如果只有1个菌落生长，并且在1区，多数时候是可以按污染处理的。当然极其重要的标本，如脑脊液，1个菌落也要充分重视。要与临床沟通。1个菌落不在1区，尤其在划线之外者，几乎都是污染。
1.4 血培养有多种分离株时，彼此的构成比要记录一下。
2．鉴定思路
2.1 鉴定思路的前提是判断临床意义。有意义则进行下一步鉴定。没有意义则完成记录即可。
比如咳痰中的甲型溶血链球菌，有多种不同分离株的情况下，都是按定植菌处理。记录即可，不必鉴定。而BALF中，如果甲链是纯生长，而且浓度>104CFU/ml，则需要鉴定、药敏。而血液中的甲链，则依赖于临床诊断。如果临床除外感染性心内膜炎IE，则是污染的概率高于感染。如果临床诊断就是IE，那甲链几乎都是病原。甲链是自体瓣膜（非人工瓣膜）非吸毒患者IE的最常见病原，构成比占到三分之二强。此时分离，必须鉴定、药敏。
这么理解很容易，举例也很简单。现实可操作性却不好，临床意义判断是临床细菌学、真菌学工作的最难点之一。
针对该难点，首先要知道不同临床诊断和不同标本下的病原谱。比如CAP和HAP不同；肺炎和AECOPD也不同[4,5]。第二要看严重程度和患者免疫力。严重病情、免疫力低下则病原谱会扩大。第三菌种毒性。第四看生长情况，比如量、与正常菌群的比对。第五与相同标本的涂片结果相结合。第六看相关标本的生长情况，如咳痰同时关注胸水等。[6]这6点容易吗？病原谱没有公认文献，细节彼此不同；患者状态除非一一核实，否则实验室难以知晓；条件致病菌毒性很难判断；生长情况和标本留取、送检、处理密切相关，不能把所见绝对化。这4点本身很难，而实际工作情况是，判断时往往不知道菌种。也许第二天鉴定出来，和前一天的推测完全不一致（这当然概率不大，取决于工作经验和快速技术手段），那前一天的判断也许完全没有意义。此外还要考虑抗生素使用等可能有些不太确定的信息。
需要强调的细节有三。
其一，比如咳痰标本，可能病原PP与正常菌群NF生长的对比非常重要。PP3+~4+，NF－～1+，则PP有意义的概率高。反之，则有意义的概率低，此时一些菌种甚至可以不必鉴定、药敏。由此，对于体表分泌物、粪便等培养，正常菌群的描述、判断都很重要。现实存在的问题是，要么不报告正常菌群，要么不报告生长的量，这样是错误的[7,8]。
其二，分离株的连续性。比如患者连续3天送检咳痰。第一天金葡4+，没报革兰阴性菌。第二天肺克4+，完全没有金葡。这样的结果会让临床莫衷一是。所以看平皿一要记忆患者姓名（要检查查LIS记录），二要保持前后连续。剧烈变化，要寻找原因（临床自身、实验室内部[比如不同操作者平皿阅读之间的差异]）。反复剧烈变化而不明原因，实验室结果可信性会大幅度下降。
其三，不要随意判定为污染。比如脑脊液出杰氏棒杆菌。不能单纯根据临床指标正常或涂片未见菌体就断定为污染。一方面少数患者有感染但临床表现不典型；另一方面涂片灵敏度低，见到菌体可以佐证，未见却不能否定。判断污染的过程是复杂的综合性过程，不要人为简化轻易得出结论。
2.2 鉴定思路和操作
对于需要鉴定的菌落，要在检查单上写明需要进一步进行的试验项目。比如革兰阳性球菌怀疑肠球菌，则记录触酶、PYR试验、apiStrept或VITEK GP等。一般药敏试验同时进行，则需要写明药敏培养基、抗生素选择、仪器卡片信息等。
操作环节注意实验要求、质量控制等，可以精益求精。操作环节需要知道两个细节。国际上规范的实验室都是传代后鉴定，一般不从原始培养基上挑取菌落鉴定。这样的优点是更准，不易污染；缺点是多了24hr传代时间。目前国内是否按国际进行调整，笔者建议暂按现状运行。因为一绝大多数原始平皿菌落的鉴定结果可靠；二质谱技术在彻底改变鉴定流程，等质谱普及后，自然会形成新的规范。
另外，国际上进行鉴定、药敏后，相应剩余的菌悬液要传代到血平皿上，第二天看是否纯生长。不纯的话，之前相应试验宣告失败。待分纯后重新试验。
3．结果记录和分析
当天记录快速实验结果。第二天或规定观察时间记录相应实验结果。综合性试验记录综合性结果，比如卡片鉴定，记录菌种、鉴定百分比等。单一实验记录阴阳性、或其他特征。比如药敏试验，记录MIC或直径、耐药性定性、特殊耐药性等。
记录要真实、全面、细致。不要遗漏和改动。原则而言，“看到什么，记录什么，报告什么”。当然，为规避法律风险等可以轻微调整，但不能陷入主观，或违背专业原则。
需要强调的是鉴定百分比。鉴定百分比不应该出现在最终临床报告上，但原始记录单上要有记录，以备核查。
结果分析：菌种、药敏信息出来后，向前要反馈分析之前的思路是否正确，原始培养基生长是否有新情况。向后要看患者综合信息，分级判断结果的临床意义[9]。
图示：检查单记录信息
尿液培养：
观察到：革兰阴性杆菌（中国蓝平皿蓝色菌落，大，湿润水滴样）纯生长，浓度105CFU/ml。
鉴定思路：VITEK 2C GN+AST GN09+手工药敏（MH琼脂，米诺环素、厄他培南、头孢哌酮舒巴坦等）
结果：大肠埃希菌（鉴定百分比99%），药敏结果…，特殊耐药性（如ESBLs、CRE）
报告：大肠埃希菌：浓度（略）、药敏（略）和特殊耐药性（略），结果评述和解释。
咳痰培养：
观察到：革兰阴性杆菌（中国蓝平皿红色菌落，大，边缘不整齐，划线生长，生姜气味，金属光泽）4+，甲链2+，凝固酶阴性葡萄球菌1+
鉴定思路：对革兰阴性杆菌：氧化酶+VITEK 2C GN+AST GN09+手工药敏（MH琼脂，多粘菌素、头孢哌酮舒巴坦等）
结果：氧化酶+，铜绿假单胞菌（鉴定百分比99%），药敏结果…，特殊耐药性（如CRPA）
报告：甲链2+，凝固酶阴性葡萄球菌1+，铜绿假单胞菌：4+、药敏（略）和特殊耐药性（略）。质量判断结果。结果评述和解释。
4．统一性
整个实验室中流程，包括标本处置、平皿阅读，要强调：实验室内部（尤其是不同操作者之间）要一致、同类标本结果的前后要一致、分析中和分析后要一致。
4.1 实验室内部一致：有一些检查流程没有国际标准，不同实验室可以不一致。但需要在实验室内保持一致，并将可能影响结果的情况告知临床，取得临床和实验室的共识。不同操作者间要保持一致，否则结果波动很大，不可信。
4.2 同类标本结果的前后一致：首先有明确的SOP文件，其次是统一施行。在此前提下，近期连续送检标本的分离株，绝大多数的菌种、量是前后一致的。不一致一定要找到原因。很多不一致的情况，必然存在错误或盲区。
4.3 分析中和分析后一致：临床实验室是为临床诊断、治疗服务的。实验室结果要尽可能和患者病情相吻合、逻辑上尽量没有矛盾、和医生判断要尽量一致。比如分析中认为没有意义的分离株（因而没有鉴定、药敏），分析后认为意义很大，就出现了不一致的状况。
5．危急值与临床沟通
脑脊液培养、血液培养等见到菌落，是微生物学实验室的危急值。完成革兰染色后要及时汇报临床、完成记录。其他标本遇到可疑之处，或者觉得需要沟通的地方，也要及时与临床取得联系。
三、阅读后的报告和应用
报告时把相应检查结果按规范方式录入LIS，进而传输到HIS中。此时注意再一次综合判断结果的价值，是否有矛盾、错误之处，把分析中环节的错误消灭在实验室内。
分析后环节是检查结果在临床的应用环节。既包括结果的临床解释，也包括临床会诊对患者进行综合判断。此时仍然要综合判断报告的价值，是否有矛盾、错误之处。由此判断出分析中环节（包括平皿阅读）出现了矛盾、错误，是很遗憾的事情，甚至可能是医疗事故。此时对于错误真假、大小、有无已经发生的直接不良影响要仔细分析。
1．真假：很多所谓的错误，并非真正的错误。比如患者没有肺炎，不考虑下呼吸道感染，送检咳痰培养。分离出肺炎克雷伯菌3+。此时的肺克是定植。如果临床认为是错误，则不是真正的错误。要向临床进行充分的解释工作（此时如果细究，实验室的错误应该是没有适应征情况下，没有执行拒收。本来连培养都不必进行的）。再如，患者用了敏感药物没有好转，或者耐药药物却治愈。临床认为报告错误。实际则可能分离株是定植（非常常见）；是感染时，90-60规则告诉我们，敏感不必然成功，耐药不必然失败[10]。
2．大小：真的错误，要判断错误大小。比如正常菌群半定量记录没有报告，这类错误不太大，影响有限。而BALF没有定量，则是比较大的错误。再如同一份标本分割送检（这种情况实际中有。当然这么做首先是临床错误，除了血培养可以分割标本外，其他标本一般都是一天1次，分割后多次送检本身是不合适的），结果彼此完全不同，也是较大的错误。而确定病原后，药敏试验错误，把本身耐药的药物报告为敏感，临床又使用了该药物导致疗程（可能）延长，这是公认的极端重要错误（very major error）。大的错误，要审慎处理。
3．直接不良影响：如果没有发生，那错误尚可挽回。如果已经发生，则要依据医务处、院方等管理部门的判断，进行处置。相应技术漏洞需要弥补，以防止后续再错。
平皿阅读是临床微生物学常规工作内容之一。因为不够“高大上”，一些从业者可能认为非常不重要。而就专业而言，这是必须做好的基础工作，是临床诊治、专业科研与教学的基础。国内实际情况非常不乐观。可以说部分实验室该环节非常混乱。笔者通过本文，试图对此进行分析、厘清，希望能对专业工作有所裨益。期待您的反馈！
参考文献
[1]Connie R. Mahon, Donald C. Lehman, George Manuselis. Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed. W. B. Saunders Company. 2011: 171.
[2]蔡文诚，蔡岳廷. 实用临床微生物诊断学. 10版. 台北：九州图书文物有限公司：147-185.
[3]王辉，任健康，王明贵. 临床微生物学检验，北京：人民卫生出版社，2015: 51-54.
[4]中华医学会 新版CAP指南
[5]Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, et al. A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM) [J]. Clin Infect Dis. 2013, 57(4):e22-e121. PMID: 23845951
[6]宁永忠，王启斌. 痰细菌培养与肺炎[J]. 中华医学杂志, 2015,
[7]Henry. D. Isenberg et al. Clinical Microbiology Procedure Handbook. ASM press, 2007:3.11.2.9.
[8]宁永忠，李明，严岩. 感染性疾病的微生物学. 北京：化学工业出版社，2013:87-136
[9]宁永忠. 细菌性感染性疾病的诊断分级[J]. 中华传染病杂志,2015,33(1):49-52.
[10]宁永忠. 感染性疾病的理念，北京：化学工业出版社，2014: 5-10.
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