调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg）是一群重要的免疫调节细胞，主要发挥免疫抑制作用，介导机体的免疫耐受和维持机体免疫系统的平衡。Treg数量或功能紊乱可导致多种自身免疫性疾病的发生，并在肿瘤、器官移植、过敏和炎症性疾病的发生和发展中发挥重要作用（见下图）。因此，流式细胞仪检测Treg已经成为临床研究的热点之一。
【实验原理】
Treg是一群来源于胸腺，高表达CD25的CD4+ T淋巴细胞。叉头样转录因子Foxp3是控制Treg细胞发育和功能的重要基因，因此Foxp3及其编码产物是目前公认的识别Treg的特异性标志物。通过特异性抗体，利用流式细胞仪可快速、准确地检测CD4+CD25highFoxp3+的Treg细胞群[1]。
【实验方法】
血液样本首先和细胞膜标记的单克隆抗体CD4，CD25一起孵育，完成细胞表面抗体标记步骤后，对血液样本进行破膜和固定处理。在进行胞内抗体标记前，先加入2%的大鼠血清进行封闭，然后加入Foxp3抗体进一步标记。通过BriCyte E6流式细胞检测，可以对这群表型为CD4+CD25highFoxp3+的Treg细胞进行识别和分析。
【试剂】
CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE及同型对照
溶血剂、固定/破膜剂、PBS缓冲液
大鼠血清（可用BSA替代）
【样本制备】
1) 取两支流式管分别标记1#管（对照管）和2#管（测试管），每管分别加入准100ul备好的细胞悬液，细胞数约为1×106个；
2) 按照试剂说明书要求每管分别加入适量以下抗体：CD4/CD25，混匀，室温避光15分钟；
3) 分别加入1x 溶血剂450ul 孵育15分钟后，离心弃上清；
4) 2ml PBS洗涤1次后，加入固定/破膜剂（Fixation/Permeabilization）避光孵育30-60分钟后，离心弃上清并用PBS洗涤1次；
5) 加入2%大鼠血清100ul，避光4℃孵育15分钟；
6) 按试剂说明书要求加入适量以下荧光标记抗体：测试管加入FOXP3抗体，对照管加入相应的同型对照抗体，避光4℃孵育30分钟；
7) PBS洗涤1次后，加入适量PBS重悬细胞，在BriCyte E6流式细胞仪上进行测定和分析。
【数据分析】
采用BriCyte E6流式细胞仪配套MRFlow软件进行数据分析。
1) 建FSC线性/SSC线性散点图，设门选取淋巴细胞群P1；
2) 建FITC（LOG）/SSC线性散点图，显示P1门内细胞，设门选取CD4阳性细胞群（P2）；
3) 建APC（LOG）/PE（LOG）散点图，显示P2门内细胞，并参照同型对照管的检测结果，设门选取CD25high阳性细胞群（P3）；
4) 读取P3门内阳性细胞比例；
5) Treg细胞比例=测试管P3门内细胞比例（%）-对照管P3门内细胞比例（%）。
【图形及结果】
对照管
测试管
（责任编辑：lgh）
