阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种罕见的、获得性克隆性造血干细胞疾病。该疾病是由于磷脂酰肌醇聚糖A(PIG-A)基因发生突变导致细胞膜GPI相关锚连蛋白缺失或部分缺失，因而对正常血清中的补体敏感而发生血管内溶血。
根据阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断与治疗中国专家共识，应用流式细胞术检测GPI锚连蛋白缺失细胞数量是诊断PNH最直接、最敏感的方法。建立PNH诊断至少要有一系及以上细胞的两种GPI锚连蛋白缺失。迄今为止，已经发现了20余种蛋白在PNH患者血细胞表面表达缺失，如CD55，CD59，HRF，CD14，CD16和CD24等。FLAER（嗜水气单胞菌溶素变异体）可特异性地结合于所有的GPI锚连蛋白，不会因为细胞表达GPI蛋白种类和数量的不同造成误差，因此FLAER对检测微小PNH克隆非常敏感，且不受输血和溶血的影响。对一些临床上高度怀疑，而CD55、CD59等检测不能确诊的病例，可以结合FLAER检查。利用流式细胞仪对PNH患者锚连蛋白的不同缺失程度进行量化，可以对PNH进行分型，以便进一步了解并检测病情进展和疗效。
【实验原理】
健康人外周血红细胞和粒细胞的锚连蛋白表达几乎完全阳性（阳性率＞95%），PNH患者由于锚连蛋白表达缺失或部分缺失，流式细胞仪检测结果会呈现锚连蛋白检测阴性或部分阴性。例如将PNH红细胞根据CD55、CD59的缺乏程度可以分为三型：TypeⅠ（补体敏感度正常）、TypeⅡ（中度敏感）、TypeⅢ（高度敏感），临床溶血程度主要取决于Ⅲ型红细胞多少。分析粒细胞和单核细胞可应用CD45/SSC设门，同时使用系列标记/FLAER多色分析（如粒细胞采用CD33/CD24/FLAER，单核细胞采用CD33/CD14/FLAER），有助于更准确地分析PNH克隆。
【实验方法】
采用CD55、CD59、CD14、CD24等抗体或FLAER作为分子探针，同时建议使用系列标记（非GPI锚蛋白，如GlyA、CD15、CD33等），与血细胞共同孵育后，采用活细胞直接免疫荧光标记法进行流式细胞术检测。
【试剂】
标记红细胞抗体：CD59/GlyA
标记粒细胞抗体：FLAER/CD24/CD45/CD33
标记单核细胞抗体：FLAER/CD14/CD45/CD33
破膜剂、固定液、缓冲液
【样本制备】
1、标记红细胞
取2支流式管，分别标记1#管和2#管，于1#管中加入20μl的GlyA；2#管中加入CD59和GlyA各20μl；
样本稀释：取10ul全血+1.5ml的PBS中，混匀后各取100ul加入上述2支流式管中，4℃避光30min；
1000 rpm离心5min，弃上清，用2ml PBS洗2遍，重悬于1ml PBS中，上机检测。
2、标记粒细胞和单核细胞
取2支流式管，分别标记1#管、2#管，于1#管中加入CD45/ CD33/CD24/FLAER各20μl（检测粒细胞）；2#管加入CD45/CD33/CD14/FLAER各20μl（检测单核细胞）；室温避光孵育30min；
每管加入2ml 1×溶血素，室温避光15min；
溶血完全后1000 rpm离心5min，弃上清，用2ml PBS洗2遍，重悬于0.5ml PBS中，上机检测。
【数据分析】
采用BriCyte E6流式细胞仪配套MRFlow软件进行数据分析。通常先做20~30份正常人血样划定阳性区（Ⅰ区）范围，同型阴性对照界定Ⅲ区范围，中间区域即为Ⅱ区。
1、红细胞分析
应用FSC（LOG） / SSC（LOG）散点图，根据红细胞物理特性进行设门P1
应用GlyA/CD59散点图，显示P1门内细胞，设P2门GlyA+红细胞CD59的表达
2、粒细胞分析
应用CD45/SSC（Lin）散点图，设P1门，圈取粒细胞；
应用CD33/CD45散点图，显示P1门内细胞，设P2门圈取CD33+CD45+的粒细胞；
应用CD24/FLAER散点图，显示P2门内细胞，分析门内CD24和FLAER的表达；
3、单核细胞分析
应用CD45/SSC（Lin）散点图，设P1门，圈取单核细胞；
应用CD33/CD45散点图，显示P1门内细胞，设P2门圈取CD33brightCD45+的单核细胞；
应用CD14/FLAER散点图，显示P2门内细胞，分析门内CD14和FLAER的表达。
【检测报告示例】
红细胞：
TypeⅢ型细胞（CD59完全缺失）占：22.87%
TypeⅡ型细胞（CD59部分缺失）占：2.79%
PNH克隆（TypeⅢ型细胞+TypeⅡ型细胞）占：25.66%
白细胞：
粒细胞：FLAER-CD24-PNH克隆细胞占：21.33%
单核细胞：FLAER-CD14- PNH克隆细胞占：40.51%
（责任编辑：lgh）
