Cell | 新成像技术揭示呼肠病毒胞内释放途径

过去的十年里，细胞和组织成像方法的发展取得了飞速的进步。利用扫描或透射电子显微镜（EM）可以将细胞超微结构成像到2-5nm的分辨率，然而EM方法的穿透深度有限，透射EM的穿透深度仅0.5mm。对于较厚的样品（如哺乳动物细胞）的三维EM成像，可以采用切片和连续重建的方法来克服这一限制，但涉及到样品的化学处理或复杂的低温工作流程。高分辨率的3D成像技术——软X射线断层成像（soft X-ray tomography，SXT），可以满足在较厚的玻璃化样品中对细胞超微结构进行中尺度成像需求，其穿透深度约为10mm，分辨率为几十纳米，样品不需要化学处理【1】。光学显微镜可以作为EM和SXT的补充，提供细胞内超微结构、细胞器组织和分子定位的直接信息。将现有的成像方法结合使用组成关联方案或在生物成像中产生更多的益处。关联成像通过提供互补的形态、结构和化学信息，对一系列细胞过程提供中澳的新见解，这些信息超出了单独使用任何一种技术所能获得的范围。例如将常规荧光显微镜（FM）与EM关联、将SXT与衍射限制的FM关联或与涉及化学固定的超分辨率FM关联。在细胞或组织取得高分辨率成像的挑战之一是保持原始细胞内结构和排列。考虑到这一点，相比于化学固定，快速冷冻成为保持生物结构或细胞内动态过程的黄金标准方法。组织透明化是用于超微结构成像的生物样品保存的非常有前景的技术，可用于X射线成像、电子断层扫描、超分辨率荧光成像等技术的样品制备。而且，与室温成像相比，低温荧光成像的特点是染料的光稳定性增强，发射光谱更清晰，从而数据具有更好的信噪比。但是，由于目前没有合适的浸没液和稳定的浸没物镜，cryo-FM系统的数值孔径（NA）受到限制。低温荧光成像是通过NA最大值为0.9的空气物镜来完成的，限制了可实现的光学分辨率，并且低温条件下成像时防止冰晶形成导致样品损坏也是一项技术挑战。3D结构化光照显微镜（3D-SIM）可成为低温条件下成像的首选方法【2】。SIM利用模式化的光与成像目标的荧光团相互作用，产生低频干涉条纹（莫尔效应），携带超过系统衍射极限的结构信息，体积分辨率提高8倍。SIM在低温成像上有诸多独特的“卖点”：1）很容易应用于多通道成像，可使用一系列常见的染料或荧光蛋白；2）可成像相对较厚的样品，减少了成像前对样品切片的需要；3）使用相对较低的光剂量和较短的图像采集时间，最大限度减少对样品加热；4）具有非常好的离焦光抑制，即使在厚度为10mm或更高的样品中也能产生高对比度图像。最近，SIM与单分子定位显微镜组成关联方案对玻璃冷冻的细胞进行可视化【3】，冷冻置换染色后通过聚焦离子束在相同细胞上进行扫描电镜成像，取得高分辨率成像。如何通过关联方案的制定实现更多高分辨率成像还有待更多的探索。2020年6月30日，来自英国的Maria Harkiolaki在Cell杂志上发表文章3D Correlative Cryo-Structured Illumination Fluorescence Microscopy and Soft X-Ray Tomography Elucidates Reovirus Intracellular Release Pathway，通过将高分辨率结构化显微镜与软X射线断层扫描技术组成关联方案，实现利用X射线和可见光在低温条件下对细胞进行三维成像。同时利用该方法研究呼肠病毒感染早期，病毒颗粒从细胞内囊泡释放的过程，鉴定细胞内病毒诱导的结构。研究人员利用高分辨率结构化显微镜（cryo-SIM）与软X射线断层扫描技术（cryo-SXT）组成关联方案。定制设计的cryo-SIM是依托于商业化cryo台的光线束B24，配备长工作距离的空气物镜（1003，0.9NA，2mm工作距离，尼康），可提供超过衍射极限分辨率的成像。高NA长工作距离的空气物镜可确保样品存放在低温环境，避免物镜浸没到冷冻液中。整个系统有四种照明波长，而且可以更改定制。同时使用向列型液晶空间光调制器用于相位调制模式产生结构化照明（SI）条纹模式，而基于液晶的偏振旋转器可针对每个条纹方向和激发波长进行独立优化，不必为下一个优化而损伤其他优化。软X射线断层扫描是由全场透射X射线显微镜（TXM）改造而来，通过吸收对比度进行成像。TXM选择k吸收边缘为284ev的碳和543ev的氧，这样一个X射线光谱区域作为照明光。这个区域内，富含碳的生物结构比周围富含氧的介质吸收更多的X射线，由此产生的自然对比度允许在记录的投射中描绘细胞特征。细胞膜提供特别强的对比度，使得膜结合的细胞器特别容易在相对较厚的整个细胞的超微结构3D断层图像中被识别。同时，通过在样品室的20X物镜和宽光谱LED照明，TXM具有基本的可见光显微镜能力，可对先前由常规或超分辨率光学显微镜识别的感兴趣区域（ROI）进行定位和标记。那么，cryo-SXT和cryo-SIM关联方案的工作流程具体如何？待成像的细胞通常生长为贴壁单层、多层或悬浮，贴壁细胞培养在金EM网格的碳膜上。在该阶段，可内源性表达荧光标记物或添加到培养基中被细胞摄取。通过多种传统的光镜和荧光显微镜方法确定培养基中或细胞的附着、生长、融合和分布，然后添加基准标志物（通常是金纳米珠）、印迹（去除多余的培养基）和插入液氮冷却的液体乙烷中进行玻璃化冷冻。玻璃化后，网格在明场和荧光中成像，并在装有荧光检测功能的冷冻级光学显微镜上绘制光束线，检查细胞形态，鉴定感兴趣区域ROI，确认无非玻璃污染物。因此，Cryo-SIM是高分辨率3D成像的第一步，cryo-SXT随后，两者的顺序不可倒置。样品放置于标准的Linkam低温保持器中，cryo-SIM首先生成网格保持器结构的明场透射2D镶嵌图，同时注释ROI，3D-SIM数据收集沿着样品z-轴进行采样。Cryo-SIM数据收集后，将样品从Linkam支架中恢复并储存网格，直到可以加载到TXM支架中。利用可见光检查和绘制网格，恢复SIM数据采集中建立的ROI，以便在相同的区域进行X射线数据采集。初步评估样品对辐射损伤的敏感性和玻璃化的均匀性，随后制定数据收集策略并收集3D射线数据。利用eC-CLEM对收集的cryo-SIM和cryo-SXT数据进行计算并构建高分辨率成像。最后，研究人员利用该技术对呼肠病毒感染的早期进行成像研究。呼肠病毒（reovirus）是无包膜的二十面体病毒，不具有细胞膜融合能力，其核心如何到达细胞质启动复制至今仍不清楚。之前的研究显示，呼肠病毒通过clathrin介导的内吞作用进入细胞，随后通过内吞小体从早期的Rab4-、Rab5-或Rab11-阳性内吞小体运输到Rab7-或Rab9-阳性内吞小体。Cryo-SIM数据成像出呼肠病毒早期感染的事件，感染后1h，内吞的呼肠病毒颗粒已经开始破坏吞内小体的膜结构，受影响的内吞小体继续进展到后期。Cryo-STX数据观察到：1）所有时间点（感染后1、2、4h）的细胞都携带病毒载量的简单囊泡群；2）一些囊泡逐渐变大，并产生多个囊泡体（MVB），这些囊泡体位于远离细胞外围靠近细胞核的地方。MVB在感染2h开始可见，并在4h内持续增长；3）携带富含碳的圆顶型结构的囊泡亚群。这些结构都只在感染2h的细胞中出现，在对照细胞的细胞质中不存在。总的来说，文章开发了cryo-SIM和cryo-SXT的关联方案，用于低温条件下对细胞的高分辨率成像，并且用呼肠病毒的感染研究对关联方案的可用性进行验证，为细胞和组织成像研究提供了新的工具。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.051
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