DNA倍体分析系统用于子宫颈癌及癌前病变的诊断及预测

孙小蓉[1] 汪键[1] Alfred Boecking[2] 武汉兰丁肿瘤早期诊断检测中心[1] 德国Heinrich Heine大学病理系[2]       许多国家几十年的防癌普查结果证实，用巴氏涂片作为子宫颈癌的筛查方法可使子宫颈癌死亡率明显下降[1,2]。然而，由于受取材方法、涂片制作、染色技巧、阅片水平等因素影响，导致巴氏细胞学方法假阴性率达15%～40%[3]。巴氏方法的另一不足是与其它常规细胞病理学诊断方法一样，对子宫颈癌前病变的发展趋向无法进行预测评估[4，5]。因此，近十年来有许多新的子宫颈癌筛查和诊断方法不断地产生和发展。如阴道镜，组织学荧光分光镜、HPV-DNA检测[6]以及细胞DNA定量分析方法等[7，8]。本文着重介绍DNA倍体分析系统在子宫颈癌早期诊断及对癌前病变的发展趋向评估中的作用。 1 细胞DNA定量分析的基本原理 每一个正常细胞核内均有23对染色体，并有固定数量不变的DNA含量（7pg）。由于细胞核内染色体是成对的，故将正常细胞称为DNA二倍体细胞（dipolid或2C细胞）。正常细胞及肿瘤细胞在生长增殖时，细胞核内DNA结构及含量都会发生变化。因此通过对细胞核内的DNA测定就能了解正常细胞周期变化及发现恶性增殖的肿瘤细胞。占人体90%以上的细胞处于细胞周期中的静止期（Go），其DNA指数（DI）为1。只有当细胞增殖时才有DNA含量的增加。G1期是细胞增殖周期中的第一个阶段，此时细胞尚未开始增殖，DI仍为1。S期为DNA复制期，DI在1~2之间， G2为有丝分裂前期，DNA倍增（14pg），DI为2。M期为有丝分裂期，细胞分裂为二个子细胞，DNA含量又恢复到7pg（图1）。细胞核DNA含量不能直接用细胞图像分析系统测量，故先用Feulgen染色法对细胞核染色，Feulgen染色中的Schiff试剂可与DNA分子特异性结合而着色，从而根据染色深浅及着色颗粒在核内分布等因素决定DNA含量。即染色越深，染色质倍数越大，DNA量愈大。由于显微镜测定的细胞只反映了其二维结构，这是因为一般显微镜不能测定细胞内的三维结构，因此所测DNA含量不能完全反映染色质的倍数。为了避免误差，在测定DNA含量时，用DNA指数来表示。即：DNA指数=被测细胞DNA含量的数字/正常细胞DNA含量在G0/G1期间峰值的数字。 G0期为静止期，G1期为细胞复制前期，G0和G1期的DI为1，即2C细胞。S期为复制期，DI介于1～2之间，即2C～4C细胞之间。G2期为有丝分裂前期，DI为2，即4C细胞。M期为有丝分裂期。 图1 细胞增殖周期示意图 DNA含量的变化可作为直接反映肿瘤增殖能力的重要生物学指标。细胞增殖取决于细胞核的DNA复制与细胞分裂。细胞癌变的本质是细胞迅速无限增殖和转移，测定细胞核DNA含量，可作为恶性肿瘤的客观指标[9]（图2、图3、图4、图5）。 子宫颈上皮细胞为DNA整倍体。左图为直方图，Y轴为细胞的数量，X轴为DNA含量（DNA指数）。可见大多数细胞分布在DI为1的部位，少数细胞在DI为2的部位。右图为DNA含量与细胞核面积分布图，子宫颈细胞核由Feulgen染色，Y轴是表示细胞核的面积的大小，以像素表示（1个像素为0.1 M2）。X轴是DNA含量（DNA指数）。 图2 一例正常子宫颈上皮DNA-ICM分析图形 子宫颈上皮细胞为DNA多倍体。左图为直方图，大多细胞分布在DI为1的部位，少数细胞在DI为2和4的部位。右图为DNA含量与细胞核面积的分布图 图3 一例增生的子宫颈上皮DNA-ICM分析图形 子宫颈上皮细胞DNA有异倍体。左图为直方图，可见有少数异倍体细胞分布在DI为4.5的部位。右图为DNA含量与细胞核面积分布图 图4 一例CIN3的子宫颈上皮DNA-ICM分析图形 子宫颈上皮有多种DNA异倍体细胞。左图为直方图，可见有多种异倍体细胞分布在DI 1.5和3.5之间。右图为DNA含量与细胞核面积分布图。 图5 一例浸润型子宫颈癌的子宫颈上皮细胞DNA-ICM分析图形 2 生物学背景 DNA异倍体的出现是遗传基因变异所致的，也是染色体异常改变的标志[7，9]。DNA-ICM通过对DNA含量测定来掌握和了解肿瘤细胞遗传基因变异过程。因此，DNA异倍体的定量分析可作为一种评估肿瘤愈后的指标[9，10]。在大多数子宫颈鳞状细胞癌及HSIL（high-grade squamous intraepithelial lesion）病例中均可发现DNA倍体异常细胞[11~13]。异倍体细胞的出现象征着染色体结构和数量出现异常变化，也是细胞恶变的早期特征。有人报道在HSIL病例中如有DNA倍体异常细胞，最终可发展成致浸润性子宫颈癌。因此，这类病例要进行相应的临床处理[14，15]。 DNA作为遗传物质，其结构和功能的异常，是细胞恶变的分子基础。在癌变过程中，染色体异倍体的出现起非常重要的作用。最近有关对CIN（cervical intraepithelial neoplasia）的研究证实，通过原位杂交的方法检测出伴有1号和7号染色体异常的宫颈磷状细胞病变，最终均有可能发展为子宫颈癌[16]。Heselmeyer等用比较基因杂交（comparative genomic hybridization,CGH）分子细胞遗传学方法在子宫颈高级别不典型增生，原位癌及浸润癌病例中发现HPV16型感染后可在染色质3q位点上出现变异基因[17]。1997年发表的另一项研究结果表明，子宫颈浸润性鳞状上皮癌II-IV期的病例中也发现上述类似情况[18]。子宫颈癌最常见的变异为染色质3q位点上有增加基因。随着子宫颈癌的进一步发展，其它染色质变异也可发生，如在1q和5p位点上的基因片段增加，在3q36~37位点上的基因缺失。此外，在子宫颈癌的病例中，可发现许多不同片段的染色质基因的增多或缺失（表1）[19]。 *此表来源于Zhang.2002.[19] 从细胞遗传学观点来看，染色质变异根据肿瘤发展阶段的不同而有不同的表现[20]。首先，在光镜下观察到个别染色体的变异，用DNA-ICM检测可发现少量异倍体细胞分布在二倍体细胞周围。随着肿瘤进一步发展，与肿瘤相关的异常染色体出现，用DNA-ICM可发现大量DNA含量相近的异倍体细胞。肿瘤进一步发展到晚期，染色体变异程度加重，DNA-ICM可检测出大量DNA含量不一的异倍体细胞（图5）。 细胞的异倍体与恶性度是密切相关的，几乎在所有的实体肿瘤中都能证实这一点[21]。Duensing等人研究发现高危型HPV感染所引起的染色体异常是通过二条途径，一是经PRb通路，影响病毒蛋白E7在细胞周期中完成中心体一分为二的过程；另一途径是通过抑制P53在细胞周期中的作用位点[22，23]。另有研究表明，中心体的异常与子宫颈病变的程度及DNA倍体异常相关[24]。CIN1到CIN2，CIN3直至浸润型子宫颈癌均与细胞中心体异常复制的数量有关，相应的DNA含量分布图也有从正常到异常的明显改变。以上所述表明，DNA异倍体改变是子宫颈癌病变的一个客观、早期、特异性的指标，并能预测具有恶性发展趋势的上皮病变。 3 DNA-ICM系统 第一例Feulgen染色标本做DNA定量分析用的是紫外线细胞图像测定仪[25]。上世纪60年代至70年代，开始出现流式细胞仪和扫描显微镜系统。由于当时这些设备较贵，而且操作费时，还需要一定经验的技术人员，因此这一技术多数仅在有特殊条件的实验室用于科研。对DNA-ICM的研发始于70年代，随后有迅猛的发展。DNA-ICM是根据朗伯-比尔光吸收定律，当一束光穿过某一物体时，光粒子被原子或分子所吸收，光强度将不同程度的减弱。其光密度值与物质的含量（DNA含量）具有相关性。细胞DNA的定量检测是通过逐一检测每一个细胞核的积分光密度值（integrated optical density）实现的，是细胞核上每一点的光密度值的累积值。显微镜拾取细胞涂片的光学信号后，被数码相机转化为模拟电信号，再经模一数转化成数学信号。经计算机处理，将运算产生的各种参数储存的图像和数据进一步分析诊断。细胞图像分析系统具有客观准确，方便使用及经济实惠的优点，其费用仅为流式细胞仪等类似设备的三分之一。因此现已广泛地运用于科研和临床诊断。已用于临床诊断的DNA-ICM系统有：SAMBA（Unilog法国）[26]，LEYTAS（Leyden.荷兰）[27]，CAS（Beeton,Dickinson,San Jose,CA美国）[28]，TAS-plas(Leitz,德国)[29]，Cyto-Savant(BCCA,加拿大)[30]，Cytometer CM-1(Hund,Wetzlar,德国)[31]。 4 影响细胞DNA定量测定的因素 组织细胞的固定、染色以及DNA定量分析测定系统扫描诊断过程中的许多因素，都能影响细胞DNA含量测定的结果。如细胞核内的DNA可因固定不好而丧失，Feulgen染色过深或过浅，DNA分析系统所用的显微镜，数码相机质量好坏等都能引起一定的误差，除此之外，在同一组织细胞内，DNA含量也存在着一些差别，但一般这种差别<2%。还有一些病理、化学物理因素可影响细胞核的DNA含量，如病毒感染（HPV、HIV）Vit B12缺乏，放射线等因素均可引起DNA含量的变化，因此在诊断肿瘤病变时，一定要将上述因素排除。 5 DNA-ICM用于子宫颈病变的临床意义 5.1 子宫颈癌及癌前病变的诊断 DNA异倍体的出现是染色质异常的表现，同时也是一种细胞癌变的特征指标。DNA-ICM不仅能识别子宫颈细胞涂片中的大量DNA异倍体细胞，还能识别少量DNA倍体异常细胞。 近二年来，武汉兰丁肿瘤早期诊断检测中心对约20,000名妇女进行了子宫颈癌普查，用DNA定量分析方法和常规细胞学方法比较二者的敏感性和特异性。经病理活检证实的73例CIN3及浸润型子宫颈癌的病例中，DNA定量分析方法敏感性为82%，特异性为71%；而常规细胞学方法则分别为52%和92%。此结果进一步证实，用DNA-ICM进行子宫颈癌的筛查，可明显提高子宫颈癌普查的阳性检出率。 上述结果与国外很多报道一致，即在大多数子宫颈癌和HSIL病例中可出现DNA倍体异常细胞[32，33]。ASCUS和LSIL病变中如出现DNA异倍体细胞，提示病变有进一步发展趋势或高危型HPV感染的可能性。Grote[34]等人最近发现CIN2、CIN3和浸润型子宫颈癌病例中，分别有64.3%、82.6%和100%伴有DNA异倍体细胞。 5.2 子宫颈癌恶性度评估 DNA含量在判断细胞的良恶性方面有重要意义。异倍体细胞越多，肿瘤细胞分化程度越低，恶性度越高，5年生存率越低。反之，则肿瘤细胞分化程度高，恶性程度低，5年生存率高。 Kashyap等[35]调查了不同级别子宫颈癌病变DNA异倍体细胞出现的频率，他们发现在高分化的鳞状上皮癌病例中有64%，中度分化鳞癌有71%，低分化鳞癌有83%的病例中可检出DNA异倍体细胞的改变。85%的子宫颈腺癌也可检出DNA倍体异常细胞。 Davey等人[36]用DNA-ICM对46例子宫颈癌患者细胞涂片检查结果发现，细胞DNA含量分布图与患者愈后有明显相关。在2C细胞周围出现异倍体细胞，提示恶性度不高，愈后较好。如果DNA-ICM图型出现了异倍体细胞的多个峰（如图5），其恶性度较高，愈后不好。另一研究[37]表明在163例病理诊断为T1b1-T2b的浸润型子宫颈癌病例中，凡出现有DNA指数>1.7或>2.5的大量异倍体细胞患者，其愈后不良。这些资料都表明DNA-ICM可用于评估子宫颈癌恶性程度及愈后。 5.3 对子宫颈疾病发展趋向的预测 并非子宫颈癌前病变一定发展成为癌，它具有进一步发展或恢复正常的双重性。从癌前病变中找出有癌变潜能和即将癌变的病例很有必要。由于癌前病变处于活跃的增生状态，DNA合成增加，DNA含量增高。DNA-ICM可精确测定DNA含量的改变，作为辅助诊断癌前病变发展趋向的一个有价值的指标，尤其是定期检测，可对病变的性质及发展趋势作出客观估计。 在一项有276例子宫颈细胞涂片的研究中发现，有73%的轻、中度不典型增生并伴有DNA异倍体病例后来发展为原位癌或浸润癌。在浸润型子宫颈癌病例中，DNA-ICM的敏感性达99%，阳性预测值达86%[14]。其它有关报道DNA-ICM用于子宫颈癌的阳性预测值均在84%和100%[32，33，38]。 上述表明，DNA-ICM对子宫颈癌和癌前病变有较高的预测值，将对临床诊断和愈后评估有所帮助[39]。如：①TBS诊断为ASCUS或LSIL，同时伴有DNA整倍体受检者，子宫颈病变大多数不会进一步发展。阴性预测值为95%，此类患者可按常规定期复查。②ASCUS或LSIL伴有DNA异倍体患者，2个月后就可发展为CIN3或原位癌，其阳性预测值设为46%；3年后大多数可发展为子宫颈癌，其阳性预测值为100%。对这些患者，一经发现，就要进行临床处理，如活检、治疗或频繁的复查。 5.4 弥补细胞病理形态学诊断的不足 造成子宫颈常规细胞学检查的假阴性除了取材制片等因素外，病理细胞学者的水平高低也至关重要。病理细胞学者水平愈高，假阴性愈低，敏感性愈高。武汉兰丁肿瘤早期诊断检测中心在73例CIN3和子宫颈癌患者中，用常规细胞学可发现LSIL以上病理改变的有38例，敏感度为52%；而DNA-ICM可发现有异倍体细胞改变的有60例，其敏感度为82%。我们的资料表明，DNA-ICM比常规细胞学更客观、更敏感。对细胞DNA含量的定量分析，可获得单纯从形态上难以得到的肿瘤生物学特征信息，不仅为用形态学评估肿瘤生物学特征提供了有价值的补充，而且有助于进一步提高对形态学的认识水平。另外，对8例子宫全切的子宫颈癌病例，做了子宫颈十二位点病理学检查（表2）。其结果显示50%子宫颈标本中仅有3~4个位点发现原位癌或更高级别的病变。其余大部分子宫颈均为正常。这就说明子宫颈癌病变都是从局部逐渐向子宫颈其余部分发展。但通常子宫颈活检仅取2~4个位点，如果活检未取到癌前或癌的组织，就可因漏诊而引致假阴性结果。对于病理活检正常，同时常规细胞学正常，但DNA-ICM发现有异倍体细胞的患者，要密切观察，在3~6个月内再做复查或做另外点位的病理活检，以免漏诊。
序号 年龄（岁） 常规细胞学检查 DNA-ICM （大于5C细胞数） 十二点位病理活检(发现CIN3或浸润型癌位点数) 1 45 LSIL >20 3 2 33 ASCUS >20 4 3 46 ASCUS >20 9 4 37 LSIL 1 9 5 39 HSIL >20 5 6 40 HSIL >20 5 7 31 Normal 3 3 8 41 LSIL >20 3 表2 8例CIN3或子宫颈癌的常规细胞学检查DNA-ICM及病理活检结果* *病理活检标本来自于武汉兰丁肿瘤早期诊断检测中心的8位子宫切除的 子宫颈组织。 作十二点位的病理检查发现CIN3/CIS，或浸润型癌部位。 5.5 对子宫颈癌疗效的评估 DNA倍体分析可用于放疗疗效的评估。1991年有关报道[40]DNA异倍体肿瘤较整倍体肿瘤患者对放疗更敏感。浸润型子宫颈癌中，异倍体细胞愈多放疗敏感愈强。 6 结论 DNA倍体分析系统用DNA含量的定量分析方法可对子宫颈癌及癌前病变进行诊断及预测，并可获得单纯从形态上难以得到的肿瘤生物学特征信息。这一方法不仅为用形态学估价肿瘤特征提供了有价值的补充，而且有助于进一步提高对形态学的认识水平。另外，DNA-ICM经济实用以及重复性好的优点将使这一新技术更广泛的运用于子宫颈癌及癌前病变的早期诊断，指导治疗及子宫颈病复发趋向的评估。 参考文献 [1] Liu S, Semenciw R, Probert A, et al. Cervical cancer in Canada: changing patterns in incidence and mortality. Int J Gynecol Cancer, 2001,11:24-31. [2] Anderson GH, Boyes DA, Benedet JL, et al. Organisation and results of the cervical cytology screening programme in British Columbia, 1955-1985. Br Med J, 1988,296:975-978. [3] Guidozzi F. Screening for cervical cancer. Obstet Gynecol Surv, 1996,51:696-701. 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