副标题#e#PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。一、PCR产物的TA克隆 1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。2.操作步骤⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。⑵ 10μl体积反应体系如下： ①取T载体1μl (50ng)，加入等摩尔数PCR产物 。②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补足至10μl 。⑶ 稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。⑷ 转染，蓝白斑筛选同前。二、注意事项1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。放射性同位素标记的DNA序列测定分析 测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。一、 试剂准备１． 硅化液：四氯化碳 250ml，二氯二甲基硅烷 25ml。２． 6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵（25%）50μl，TEMED 50μl，轻摇混匀，立即灌胶。3.质粒DNA碱变性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），无水乙醇，70%乙醇。4.T7测序试剂盒。二、操作步骤1. 测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。2. 灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。夹好，将测序板放水平。聚合约3hr后预电泳。3. 预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。设置温度50℃，功率100W，时间约30min。（同时准备测序反应）
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