PCR实验室污染的原因及监控

王 升 （中山大学达安基因诊断中心，广州 510665）
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏度，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
1 污染原因
1.1 标本间交叉污染
标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于加样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
1.2 PCR试剂的污染
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
1.3 PCR扩增产物污染
这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1 013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染加样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算1个气溶胶颗粒可含48 000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
1.4 实验室中克隆质粒的污染
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
2 污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
对照试验 （1）阳性对照：PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样本污染的可能性很大，在使用过程中注意防止污染。 （2）阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。 （3）重复性试验。 （4）选择不同区域的引物进行PCR扩增。
（责任编辑：labweb）