RT┐PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达

张聚良　王岭　晋援朝　黄庆生　金卫林
　　摘 要:目的  观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及β3整合素mRNA在肉芽组织血管生成中表达的动态变化. 方法  采用RT-PCR法定量分析人正常皮下组织、增殖期肉芽组织（伤后7～12d）及成熟期肉芽组织（伤后30～35d）VEGF及β3整合素mRNA的水平. 结果  在正常皮下组织中，VEGF及β3整合素mRNA呈低表达，而在增殖期肉芽组织中表达升高，待肉芽组织完全成熟后二者的表达又有所降低. 结论  VEGF及β3整合素mRNA的水平与肉芽组织的血管生长过程呈动态相关，提示两种蛋白质可能在肉芽组织血管生成中发挥调节作用.
    
　　Analysis of VEGF and integrinβ3mRNA expression during angiogenetic process in granulation tissue with RT┐PCR
    
　　ZHANG Ju-Liang　WANG Ling　JIN Yuan-Chao　HUANG Qing-Sheng　JIN Wei-Lin
 
    1 Department of Vascular Surgery，Xijing Hospital，
    
　　2 Department of Microbiology，Faculty of Preclinical Medicine，
    
　　3 Institute of Neurosciences of Chinese PLA，Fourth Military Medical University，Xi’an710033，China
     
　　Keywords:reverse transcription PCR;neovascularization，pathologic;endothelial growth factors;integrins
    
　　Abstract:AIM To observe the dynamic changes in the ex-pression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and integrinβ3mRNA during the angiogenetic process of granula-tion tissue.METHODS VEGF and integrinβ3mRNA inhuman normal subcutaneous tissue，proliferative granulation tissue（7～12days post-injured）and mature granulation tis-sue（30～35days post-injured）were quantitatively analyzed with RT-PCR.RESULTS In normal subcutaneous tissue，VEGF and integrinβ3mRNA were expressed low while in proliferative granulation tissue they were up-regulated.When granulation tissue was mature completely，the expres-sion of VEGF and integrinβ3declined again.CONCLUSION The levels of VEGF and integrinβ3mRNA are related to the growth of vessels in granulation tissue，which suggests that these two proteins may play an important role in regulat-ing the angiogenetic process of granulation tissue.
    
　　0 引言
    
　　血管生成指在已有血管床基础上长出新的毛细血管的过程，包括血管内皮细胞的激活，细胞外基质的降解，内皮细胞的增殖、移行，管腔结构形成及血管外膜的形成，然而迄今为止确切的机制尚不清楚.已有研究表明，许多病理过程如肿瘤的生长及转移、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎等，都与血管生成密切相关［1］ .生理状态下，血管生成仅存在于胚胎发育、创伤愈合及女性生殖周期中，与病理性血管生成不同，这些过程中血管的生长受到严格调控，包括了增殖、成熟、退化三个阶段，反映了血管生成的全过程.然而，对这些过程中血管生成的研究却很少.生长因子和粘附分子作为血管生成的重要调节分子，越来越受到人们的重视，其中血管内皮生长因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）和β3整合素是近年研究的热点.本实验旨在观察肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达，揭示它们与生理性血管生成的关系.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料  肉芽组织标本均取自我院门诊换药室患者，4例为皮肤撕脱伤，1例为狗咬伤，患者年龄20～30岁，排除糖尿病等影响伤口愈合的疾患，分别于伤后7～12d和30～35d取创面组织.正常皮下组织取自我院手术患者.
    
　　1.2 试剂及仪器  异硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV逆转录酶、Taq酶、dNTP，RNAsin分别购自原平生物公司和Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480，美国PE公司;GDS凝胶成像系统，美国UVP公司.
   
　　1.3 RT┐PCR
    
　　1.3.1 引物设计  按文献报道［2，3］，VEGF上游引物序列:5′-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3’，下游引物序列:5′-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3’，PCR产物为567bp，495bp和363bp，β3整合素上游引物序列:5′-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3’，下游引物序列:5′-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3’，PCR产物为285bp.
    
　　1.3.2 总RNA提取及定量  所取组织用Chom-czynski改良一步法提取总RNA，通过测定A260 值计算RNA浓度，A260 /A280 判定纯度.
    
　　1.3.3 RT-PCR反应  各组织总RNA均取1μg（10μL），加25μmol·L-1 逆转录引物（下游引物）1μL，70℃10min后立刻冰浴，加入下列成分:DW5μL，5x RT缓冲液5μL，10mmol·L-1 dNTP各1μL，RNasin0.5μL（25U），AMV1μL（5U），42℃逆转录1h，94℃5min，冰浴5min.各取RT产物10μL，进行PCR扩增，反应条件同于常规PCR，循环温度为:94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环数分别采用15，20，25和30，根据结果选择合适循环数，避免PCR反应平台期，最终确定为25个循环，0.2g·L-1 琼脂糖凝胶观察结果.
    
　　1.3.4 荧光分析  琼脂糖凝胶电泳结束后，在UVP凝胶成像系统上摄像，并用相应软件通过对条带大小及深浅的差别分别对不同组织RT-PCR扩增产物进行定量分析，结果采用完全随机化设计资料均数的t检验进行统计分析.
    
　　2 结果
    
　　VEGF有多种不同的mRNA拼接产物，本实验选用引物可扩增出VEGF121 （363bp），VEGF165 （495bp）和VEGF189 （567bp）3种形式.电泳结果表明，VEGF可见3条扩增带，大小同预期设计一致（Fig1）β3整合素PCR产物为265bp，电泳显示300bp附近可见明显扩增带，与预期一致（Fig2）由电泳结果可以看出，正常皮下组织中VEGF及β3整合素mR-NA水平极低，在增殖期肉芽组织中表达明显升高，在成熟期肉芽组织中表达又降低，而且，在VEGF的 3种不同拼接产物中，VEGF165 表达最高.
   
　　图像分析定量的结果表明，在增殖期肉芽组织中，VEGF及β3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽组织（P<0.05）及正常皮下组织（P<0.01，Tab1）.      　　图1 － 图2 　略      　　3 讨论      　　VEGF是近年发现的可以特异性作用于血管内皮细胞（EC）的生长因子.体外实验证明VEGF可以直接促进EC的增殖，还可以通过提高已有血管的通透性，使血浆蛋白渗入基质，利于EC的移行，间接促进血管生成［4］ .β3整合素属粘附分子家族成员，可与αIIb或αV亚基结合，其中αVβ3分子在血管生成中的作用备受关注，表达于细胞膜表面，识别细胞外基质的RGD序列，对于EC的移行有重要意义［5］ .本实验表明，正常皮下组织中没有血管生成的存在，VEGF及β3整合素mRNA的表达很低;在肉芽组织增殖期，HE切片证明EC在局部聚集成团，胞质增多，增殖明显，增殖的EC借助与细胞外基质的结合移行形成大量新生血管芽，此时VEGF及β3整合素水平明显增高，待肉芽组织完全成熟后，新生血管逐渐成熟退化，二者的表达也随之下降，表明VEGF及β3整合素可能是血管生成重要的始动分子，对于维持血管生成也有重要作用;同时也提示它们可以作为临床血管生成治疗的“靶分子”.VEGF及β3整合素受控表达的机制尚不清楚，缺氧及某些炎症因子可能参与其中的调节［6，7］ .      　　表1 不同组织中VEGF及β3整合素mRNA表达水平的定量分析结果　略            　　RT-PCR适于用Northern blot检测不到的低丰度RNA.实验证明，同一循环体系下，模板量在一定浓度范围内时，PCR产物条带强度与模板量成比例关系;当循环次数处于PCR扩增的对数增长期时，PCR产物的荧光强度同模板量亦成比例关系［8］ ，因此用RT-PCR定量分析mRNA的关键是严格优化实验条件，如模板量及循环次数的控制等，本实验重复几次结果一致.   　　参考文献:      　　［1］Folkman J.Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoid and other disease ［J］.Nature Med，1995;1（1）:27-37.       ［2］Tischer E，Mitchell R，Hartman T，Silva M，Gospodarowicz D，Fiddes JC，Abraham JA.The human gene for vascular endothe-lial growth factor.Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing ［J］.J Biol Chem，1991;266（18）:11947-11954.       ［3］Figzgerald LA，Sleiner B，Rall SC，Lo SS，Phillips DR.Protein sequence of endothelial glycoprotein derived from a cDNA clone:Identify with platelet glycoprotein and similarity to“inte-grin”［J］.J Biol Chem，1987;262（9）:3936-3939.       ［4］Auerbach R，Auerbach W，Polakowski I.Assays for angiogene-sis:A review ［review］［J］.Pharmacol Ther，1991;51（1）:1-11.       ［5］Augustin HG，Braun K，Telemenakis I，Modlich U，Kuhn W.Ovarian angiogenesis:Phenotypic characterization of endothelial cells in a physiological model of blood vessel growth and regres-sion ［J］.Am J Pathol，1995;147（2）:339-351.       ［6］Dvorak HF，Brown LF，Detmar M，Dvorak AM.Vascular per-meability factor/vascular endothelial growth factor，microvas-cular hyperpermeability，and angiognesis ［review］［J］.Am J Pathol，1995;146（5）:1029-1039.       ［7］Arnold F，West DC.Angiogenesis in wound healing ［review］ ［J］.Pharmacol Ther，1991;52（3）:407-422.       ［8］Dai JG，Xiao HS，Zhang P.Quantitative analysis of mRNA with RT-PCR ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（3）:242-244.      　　编辑 许福明   　　第四军医大学:1 西京医院血管内分泌外科，     　　　　　　　　 2 基础部微生物学教研室，     　　　　　　　　 3 全军神经科学研究所，陕西西安710033   　　作者简介: 张聚良（1975-），男（汉族），河北省石家庄市人.硕士，医师，助教.Tel.（029）3375271（O） Email.surgeon@263.net  （责任编辑：labweb）