RT-PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达

观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及β3整合素mRNA在肉芽组织血管生成中表达的动态变化. 方法  采用RT-PCR法定量分析人正常皮下组织、增殖期肉芽组织（伤后7～12d）及成熟期肉芽组织（伤后30～35d）VEGF及β3整合素mRNA的水平. 结果  在正常皮下组织中，VEGF及β3整合素mRNA呈低表达，而在增殖期肉芽组织中表达升高，待肉芽组织完全成熟后二者的表达又有所降低. 结论  VEGF及β3整合素mRNA的水平与肉芽组织的血管生长过程呈动态相关，提示两种蛋白质可能在肉芽组织血管生成中发挥调节作用.
引言
     
　　血管生成指在已有血管床基础上长出新的毛细血管的过程，包括血管内皮细胞的激活，细胞外基质的降解，内皮细胞的增殖、移行，管腔结构形成及血管外膜的形成，然而迄今为止确切的机制尚不清楚.已有研究表明，许多病理过程如肿瘤的生长及转移、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎等，都与血管生成密切相关［1］ .生理状态下，血管生成仅存在于胚胎发育、创伤愈合及女性生殖周期中，与病理性血管生成不同，这些过程中血管的生长受到严格调控，包括了增殖、成熟、退化三个阶段，反映了血管生成的全过程.然而，对这些过程中血管生成的研究却很少.生长因子和粘附分子作为血管生成的重要调节分子，越来越受到人们的重视，其中血管内皮生长因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）和β3整合素是近年研究的热点.本实验旨在观察肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达，揭示它们与生理性血管生成的关系.
     
　　1 材料和方法
     
　　1.1 材料  肉芽组织标本均取自我院门诊换药室患者，4例为皮肤撕脱伤，1例为狗咬伤，患者年龄20～30岁，排除糖尿病等影响伤口愈合的疾患，分别于伤后7～12d和30～35d取创面组织.正常皮下组织取自我院手术患者.
     
　　1.2 试剂及仪器  异硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV逆转录酶、Taq酶、dNTP，RNAsin分别购自原平生物公司和Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480，美国PE公司;GDS凝胶成像系统，美国UVP公司.
    
　　1.3 RT┐PCR
     
　　1.3.1 引物设计  按文献报道［2，3］，VEGF上游引物序列:5′-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3’，下游引物序列:5′-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3’，PCR产物为567bp，495bp和363bp，β3整合素上游引物序列:5′-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3’，下游引物序列:5′-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3’，PCR产物为285bp.
     
　　1.3.2 总RNA提取及定量  所取组织用Chom-czynski改良一步法提取总RNA，通过测定A260 值计算RNA浓度，A260 /A280 判定纯度.
     
　　1.3.3 RT-PCR反应  各组织总RNA均取1μg（10μL），加25μmol·L-1 逆转录引物（下游引物）1μL，70℃10min后立刻冰浴，加入下列成分:DW5μL，5x RT缓冲液5μL，10mmol·L-1 dNTP各1μL，RNasin0.5μL（25U），AMV1μL（5U），42℃逆转录1h，94℃5min，冰浴5min.各取RT产物10μL，进行PCR扩增，反应条件同于常规PCR，循环温度为:94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环数分别采用15，20，25和30，根据结果选择合适循环数，避免PCR反应平台期，最终确定为25个循环，0.2g·L-1 琼脂糖凝胶观察结果.
     
　　1.3.4 荧光分析  琼脂糖凝胶电泳结束后，在UVP凝胶成像系统上摄像，并用相应软件通过对条带大小及深浅的差别分别对不同组织RT-PCR扩增产物进行定量分析，结果采用完全随机化设计资料均数的t检验进行统计分析.
     
　　2 结果
     
　　VEGF有多种不同的mRNA拼接产物，本实验选用引物可扩增出VEGF121 （363bp），VEGF165 （495bp）和VEGF189 （567bp）3种形式.电泳结果表明，VEGF可见3条扩增带，大小同预期设计一致（Fig1）β3整合素PCR产物为265bp，电泳显示300bp附近可见明显扩增带，与预期一致（Fig2）由电泳结果可以看出，正常皮下组织中VEGF及β3整合素mR-NA水平极低，在增殖期肉芽组织中表达明显升高，在成熟期肉芽组织中表达又降低，而且，在VEGF的 3种不同拼接产物中，VEGF165 表达最高.
    
　　图像分析定量的结果表明，在增殖期肉芽组织中，VEGF及β3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽组织（P<0.05）及正常皮下组织（P<0.01，Tab1）.       　　图1 － 图2 　略       　　3 讨论       　　VEGF是近年发现的可以特异性作用于血管内皮细胞（EC）的生长因子.体外实验证明VEGF可以直接促进EC的增殖，还可以通过提高已有血管的通透性，使血浆蛋白渗入基质，利于EC的移行，间接促进血管生成［4］ .β3整合素属粘附分子家族成员，可与αIIb或αV亚基结合，其中αVβ3分子在血管生成中的作用备受关注，表达于细胞膜表面，识别细胞外基质的RGD序列，对于EC的移行有重要意义［5］ .本实验表明，正常皮下组织中没有血管生成的存在，VEGF及β3整合素mRNA的表达很低;在肉芽组织增殖期，HE切片证明EC在局部聚集成团，胞质增多，增殖明显，增殖的EC借助与细胞外基质的结合移行形成大量新生血管芽，此时VEGF及β3整合素水平明显增高，待肉芽组织完全成熟后，新生血管逐渐成熟退化，二者的表达也随之下降，表明VEGF及β3整合素可能是血管生成重要的始动分子，对于维持血管生成也有重要作用;同时也提示它们可以作为临床血管生成治疗的“靶分子”.VEGF及β3整合素受控表达的机制尚不清楚，缺氧及某些炎症因子可能参与其中的调节［6，7］ .       　　表1 不同组织中VEGF及β3整合素mRNA表达水平的定量分析结果　略             　　RT-PCR适于用Northern blot检测不到的低丰度RNA.实验证明，同一循环体系下，模板量在一定浓度范围内时，PCR产物条带强度与模板量成比例关系;当循环次数处于PCR扩增的对数增长期时，PCR产物的荧光强度同模板量亦成比例关系［8］ ，因此用RT-PCR定量分析mRNA的关键是严格优化实验条件，如模板量及循环次数的控制等，本实验重复几次结果一致.   　　参考文献:       　　［1］Folkman J.Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoid and other disease ［J］.Nature Med，1995;1（1）:27-37.       ［2］Tischer E，Mitchell R，Hartman T，Silva M，Gospodarowicz D，Fiddes JC，Abraham JA.The human gene for vascular endothe-lial growth factor.Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing ［J］.J Biol Chem，1991;266（18）:11947-11954.       ［3］Figzgerald LA，Sleiner B，Rall SC，Lo SS，Phillips DR.Protein sequence of endothelial glycoprotein derived from a cDNA clone:Identify with platelet glycoprotein and similarity to“inte-grin”［J］.J Biol Chem，1987;262（9）:3936-3939.       ［4］Auerbach R，Auerbach W，Polakowski I.Assays for angiogene-sis:A review ［review］［J］.Pharmacol Ther，1991;51（1）:1-11.       ［5］Augustin HG，Braun K，Telemenakis I，Modlich U，Kuhn W.Ovarian angiogenesis:Phenotypic characterization of endothelial cells in a physiological model of blood vessel growth and regres-sion ［J］.Am J Pathol，1995;147（2）:339-351.       ［6］Dvorak HF，Brown LF，Detmar M，Dvorak AM.Vascular per-meability factor/vascular endothelial growth factor，microvas-cular hyperpermeability，and angiognesis ［review］［J］.Am J Pathol，1995;146（5）:1029-1039.       ［7］Arnold F，West DC.Angiogenesis in wound healing ［review］ ［J］.Pharmacol Ther，1991;52（3）:407-422.       ［8］Dai JG，Xiao HS，Zhang P.Quantitative analysis of mRNA with RT-PCR ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（3）:242-244.         　　第四军医大学:1 西京医院血管内分泌外科，      　　　　　　　　 2 基础部微生物学教研室，      　　　　　　　　 3 全军神经科学研究所，陕西西安710033   　　作者简介: 张聚良（1975-），男（汉族），河北省石家庄市人.硕士，医师，助教.Tel.（029）3375271（O） Email.surgeon@263.net  （责任编辑：sgx）