专家点评 | 陶生策组报道细菌蛋白质去乙酰化CobB与原核第二信使c-di-GMP间的双向调控通l路

环二鸟苷酸cyclic di-GMP / c-di-GMP是在细菌中广泛存在的第二信使分子，于1987年由Moshe Benziman等在醋酸纤维杆菌中首次发现【1】，迄今为止，已经发现了c-di-GMP在细菌运动、生物膜形成、毒力以及转录调控等方面发挥重要作用【2】。作为第二信使分子，c-di-GMP可以全局性地调控细菌的生理过程，但是其与能量代谢通路的关系至今仍未知。 CobB是细菌中第一个被发现的蛋白质去乙酰化酶，属于Sir2家族去乙酰化酶，在原核生物中高度保守。CobB可广泛地调控细菌的生理功能，如乙酰辅酶A合成【3】、细菌趋化性运动【4】、DNA解螺旋【5】等。但是，细菌体内调控CobB活性的因子却极少报道。 2019年8月17日，上海交通大学系统生物医学研究院陶生策课题组在The EMBO Journal杂志发表了研究成果Interplay between the bacterial protein deacetylaseCobB and the second messenger c-di-GMP，该研究揭示了细菌去乙酰化酶CobB和原核第二信使分子c-di-GMP在体内的相互调控关系。该研究分两个层面：1. 首次发现c-di-GMP与CobB有较强结合并通过结合调控CobB的蛋白质去乙酰化酶活性, 2. 进一步发现c-di-GMP的一个重要合成酶DgcZ的乙酰化可被CobB特异去除，乙酰化的去除可改变DgcZ的活性，从而调控细胞内c-di-GMP的水平。  首先，研究人员利用大肠杆菌蛋白质组芯片（包含4016种大肠杆菌所编码的蛋白质）【6】，发现c-di-GMP与CobB具有较强的相互作用。进一步的体内实验表明，在大肠杆菌中c-di-GMP通过结合抑制CobB的去乙酰化酶活性进而调控CobB-Acs-CoA途径中乙酰辅酶A的最终合成。通过位点突变实验，发现c-di-GMP结合在CobB N端的R8，R17以及E21 等3个氨基酸残基上。通过序列比对发现，这三个位点在原核生物中广泛保守。紧接着，研究人员选择沙门氏杆菌的CobB进行验证，结果显示c-di-GMP同样能够结合并抑制沙门氏杆菌CobB的活性，这些结果表明c-di-GMP对CobB的调控很可能在原核生物中广泛存在。图：SILAC实验表明c-di-GMP全局性影响CobB去乙酰化酶活性 其次，本研究还发现大肠杆菌的一个关键c-di-GMP合成酶DgcZ在体内能够被乙酰化，且CobB可通过去除DgcZ K4位点的乙酰化而提高DgcZ的活性，并进而调控胞内c-di-GMP的水平。在分子机制方面，研究人员发现DgcZ K4的乙酰化可导致其多聚和沉淀，而CobB的去乙酰化能够促进DgcZ蛋白的稳定性。 图：CobB通过去乙酰化活性调节DgcZ的蛋白稳定性 综上所述，本研究揭示了细菌去乙酰化酶CobB和第二信使c-di-GMP的相互调控，在体内形成了一个负反馈调节通路，为c-di-GMP研究提供了全新的效应蛋白，也为CobB在体内的调控因子提供新的证据。本研究再次展示了蛋白质芯片在新型功能发现研究方面的高效性和有效性。图：CobB和c-di-GMP在体内形成负反馈调节通路 本项研究的共同第一作者是上海交通大学博士研究生许钊葳、博士后张海南和清华大学博士研究生张行润。本研究的合作者包括清华大学李海涛教授，中科院上海药物所谭敏佳研究员，以及上海交通大学生物医学工程学院Daniel M. Czajkowsky教授。上海交通大学系统生物医学研究院陶生策研究员为通讯作者。专家点评姚玉峰 上海交通大学基础医学院 蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质生物学功能的关键步骤之一，也是细胞信号网络调控的重要靶点。这些修饰可以改变蛋白的结构、稳定性以及功能，从而对生命活动产生一系列影响。乙酰化修饰是一种可逆且高度受控的蛋白质翻译后修饰。通过乙酰基转移酶将乙酰基团加到蛋白质赖氨酸残基的ε-NH2或者α-NH2位上，通过去乙酰化酶去除乙酰基团。在真核生物中最早发现组蛋白乙酰化/去乙酰化参与细胞染色质结构改变以及核内转录调控因子的调控。之后在非组蛋白中也发现了普遍的蛋白质乙酰化修饰现象，如p53和NF-κB等，参与调控细胞凋亡、亚细胞定位、DNA和蛋白质相互作用及蛋白质稳定性等。 近年来，原核生物的蛋白乙酰化研究，特别是在病原菌如鼠伤寒沙门菌、结核分枝杆菌等中取得了较大进展。2002年在沙门菌中发现乙酰基转移酶Pat可通过乙酰化有效抑制乙酰辅酶A合成酶（Acs)的活性，NAD+依赖的去乙酰化酶CobB可激活Acs。随后发现乙酰化可以调控沙门菌初级代谢途径中多种酶的活力，协调细胞中的能量和碳源的产生和消耗，使得沙门菌能够很好地适应环境变化。这些研究提示高度保守的乙酰化修饰可以对细菌中多种蛋白进行时空特异性的调控。 研究表明，乙酰基转移酶Pat积极地参与细菌各项生命活动过程，但去乙酰化酶CobB的直接表型鲜有报道，目前仅知尼克酰胺是其抑制剂，所以CobB自身活力调控机制还非常不清楚。 陶生策实验室利用其发展的蛋白质芯片技术，发现细菌中广泛存在的环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）可以抑制CobB的去乙酰化酶活性。进一步的SILAC实验表明c-di-GMP可以全局性地抑制CobB的活性，从而影响大量蛋白质的乙酰化修饰及活力。最后他们还明确了c-di-GMP的CobB结合位点，以及CobB和c-di-GMP的相互调节机制。基于二者的高度保守性，研究结果暗示c-di-GMP对CobB的调控可能是一种原核生物的普遍现象。 陶生策实验室长期从事基于蛋白质芯片的研究工作，建立了成熟的蛋白质组学平台，特别是在大肠杆菌、肺结核分枝杆菌等重要细菌中取得了一系列原创性发现。本次工作是和他实验室在相关领域的长期系统性积累分不开的。 专家点评张勇 丹麦哥本哈根大学生物系功能基因组学中心 基于核苷酸的次级信号分子在细菌调节其生理、生化、代谢及感染宿主过程中起着广泛且重要的作用。这些信号分子中又以cyclic di-GMP/cdG研究的最多，且cdG参与调控多种生理途径。即便如此，cdG自从1987年被发现以来，在模式细菌E. coli中的受体蛋白一直未见系统报道，直到上海交通大学系统生物医学研究院陶生策研究组最近发表在The EMBO Journal上的研究论文。该文首先使用E. coli蛋白质组芯片和生物素标记的cdG分子，筛选到8个cdG受体蛋白，并随后对其中的去乙酰化酶CobB进行了深入的体内和体外研究。通过综合利用一系列技术手段（包括生物化学、酶学、细菌遗传学、蛋白组学等），该文以详实的数据漂亮地解析了cdG调节蛋白乙酰化从而调控细菌生理的分子机制。作者发现，cdG异构抑制CobB的去乙酰酶学活性，从而抑制下游蛋白Acs的去乙酰化过程和乙酰辅酶A的合成。同时，CobB能去除cdG合成酶DgcZ的乙酰化修饰，从而激活DgcZ进一步合成cdG。由此，cdG和CobB构成一个相互调控的负反馈抑制通路，以此精细调节细菌生理代谢。值得一提的是，该课题组在2014年就利用类似的技术在重要的致病菌结核分枝杆菌中找到众多cdG受体蛋白（Deng et al., Cell Report, 2014）【7】。这些受体蛋白的发现和报道为深入研究cdG调控细菌生理生化过程的分子机制铺平了道路。此外，寻找次级信号分子的受体蛋白在技术上一直非常有挑战性。陶生策组两篇力作证明了基于蛋白质组芯片的技术手段在这一问题上的重要价值。 原文链接：https://doi.org/10.15252/embj.2018100948制版人：小娴子参考文献1. ROSS, P. et al. Regulation of cellulosesynthesis in Acetobacter xylinum by cyclic diguanylic acid. Nature 325, 279-281, doi:10.1038/325279a0 (1987).. Romling, U., Galperin, M. Y. & Gomelsky, M. Cyclicdi-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger. Microbiology and Molecular Biology Reviews77, 1-52, doi:10.1128/mmbr.00043-12(2013).3. Starai, V. J., Celic, I., Cole, R. N., Boeke, J. D. &Escalante-Semerena, J. C. Sir2-dependent activation of acetyl-CoA synthetase bydeacetylation of active lysine. Science298, 2390-2392,doi:10.1126/science.1077650 (2002).4. Li, R. et al.CobB regulates Escherichia coli chemotaxis by deacetylating the responseregulator CheY. Molecular microbiology76, 1162-1174, doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07125.x(2010).5. Zhou, Q., Zhou, Y. N., Jin, D. J. & Tse-Dinh, Y.-C.Deacetylation of topoisomerase I is an important physiological function of E.coli CobB. Nucleic acids research,doi:10.1093/nar/gkx250 (2017).6. Chen, C. S. et al.A proteome chip approach reveals new DNA damage recognition activities inEscherichia coli. Nature methods 5, 69-74, doi:10.1038/nmeth1148 (2008).7. Deng, J. et al.Mycobacterium tuberculosis proteome microarray for global studies of proteinfunction and immunogenicity. Cell reports9, 2317-2329,doi:10.1016/j.celrep.2014.11.023 (2014).
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