乳腺癌基因诊断新技术

本文来源：中华乳腺病杂志（电子版）, 2020,14(05) : 303-307.引用本文: 贾宁. 基于新一代测序技术的乳腺癌基因诊断 [J/CD] . 中华乳腺病杂志（电子版）,2020,14 (05): 303-307. DOI: 10.3877/cma.j.issn.1674-0807.2020.05.008引言乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺不是维持人体生命活动的重要器官，因此原位乳腺癌并不致命，但癌细胞随血液或淋巴液播散到全身重要脏器，则可危及生命。美国国立癌症研究所预计2018年美国将新增26万例乳腺癌患者(占新增癌症患者总数的15.3%)，约4万例乳腺癌致死病例(占癌症总死亡人数的6.7%)[1]。虽然中国妇女乳腺癌发病率低于世界平均水平，但增长迅速，自1990年以来其上升速率约为全球平均增长速率的2倍[2]。根据2015年的恶性肿瘤统计数据，乳腺癌发病率已跃居中国女性新发癌症的首位，病死率为第6位[3]，对广大女性身体健康造成了极大的威胁。乳腺癌的早诊断、早发现、早治疗能提高患者的生存率，为了诊断出更早期的乳腺癌患者，并提高诊断的准确性，基因诊断的研究越来越深入，因此，笔者就乳腺癌基因诊断新技术进行综述。一、乳腺癌早期诊断的意义和现状乳腺癌是少数几种能通过早期诊断而降低病死率的恶性肿瘤之一。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌患者的5年OS率分别为96.8%、73.7%和46.4%，10年OS率分别为78.7%、64.6%和33.5%[4]。美国Ⅰ期乳腺癌确诊患者占比为62%[1]，而中国仅有20%[5]，仍有大量晚期乳腺癌患者，因确诊太晚而无法接受有效的治疗。因此，防控乳腺癌的关键在于通过早期筛查及时发现乳腺癌患者，从而提高患者的治疗效果和生活质量。但由于早期乳腺癌往往不具备典型的临床症状和体征，且大多数肿块为无痛性，很容易被忽视。目前常用的乳腺癌筛查手段有MRI、乳腺X线检查和超声检查等，这些影像学辅助检查各有优劣，在临床诊断中往往需要联合使用[6,7,8]，增加了患者的诊断费用和时间成本。基因诊断与常规影像学检查相比，具有明显的优势。因为先天遗传因素或者后天环境因素都参与了乳腺癌的发生、发展，其中人体遗传物质(基因)的改变是引发乳腺癌的关键性因素之一[9]。因此，通过研究并检测患者基因序列的变化，能在出现典型的临床表现之前更早的确诊乳腺癌，提高癌症防治水平。二、乳腺癌的易感基因正常乳腺上皮细胞中存在多种原癌基因(oncogene)和抑癌基因(tumor suppressor gene)，它们共同调节细胞生长的正、负平衡，使细胞的分裂和增殖按有节制的方式进行[10]。当这2类基因发生质变(点突变、重组、转位、部分或全部缺失)和量变(拷贝数增加)时，导致原癌基因活化和抑癌基因失活，就会引发细胞生长失衡、增殖失控；当细胞增殖失控积累到一定程度时就会引发癌变[11]。目前已知原癌基因有HER-2、PIK3CA、c-myc、Int-2、Ras、hTERT、CDH1和ESR1，抑癌基因有TP53、BRCA1、BRCA2、BARD1、PALB2、Rb、nm23、PTEN、ATM、BRIP1、CHEK2、NBN和STK11。其中比较重要的基因有HER-2、磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylino-sitol 3-kinase, PI3K)、c-myc、ESR1、肿瘤蛋白53(tumor protein 53，TP53)、BRCA1/2和PALB2。HER-2是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的EGFR家族蛋白。HER-2基因的致癌机制是抑制细胞凋亡，促进细胞增殖；增加肿瘤细胞的侵袭力，提高转移风险；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。30%以上的人类肿瘤中存在HER-2基因的扩增(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等)，其中20%～30%的原发浸润性乳腺癌存在HER-2基因的扩增[12]。目前，HER-2基因是重要的乳腺癌治疗靶点和预后指标。PI3K信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，磷脂酰肌醇激酶-3催化亚基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PI3KCA)负责编码PI3K的一个催化亚基。PIK3CA基因突变后可导致激酶活性增强，持续活化下游的蛋白激酶B，从而减少细胞凋亡，导致乳腺上皮细胞和成纤维细胞的增殖和转化[29]，约18%～40%的乳腺癌患者中有PIK3CA基因突变[13]。c-myc基因属于核蛋白类原癌基因。c-myc基因参与细胞凋亡的调节，它可使细胞无限增殖，获得永生化能力，与乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、视网膜母细胞瘤、成骨肉瘤等多种肿瘤的发生、发展都密切相关。约40%的乳腺癌患者有c-myc基因扩增[14]。如果下调乳腺癌细胞系中c-myc基因的表达，则能抑制乳腺癌细胞的增殖[30]。ESR1基因编码ERα。该基因位于6号染色体，由配体结合、DNA结合和转录激活3个结构域组成。ERα属于类固醇激素受体超家族成员，是一种配体依赖性转录因子，可与雌激素特异性地结合。该蛋白定位于细胞核，可与ERβ形成同源二聚体或异源二聚体。ESR1基因突变与乳腺癌转移密切相关，在乳腺癌的发生、治疗和预防中具有重要作用[19]。TP53基因是一种重要的抑癌基因，其编码蛋白TP53不仅可以阻止肿瘤细胞分裂，诱导肿瘤细胞凋亡，还可以修复正常DNA的损伤，因而被称为人体的”基因警察”。TP53也是迄今发现的与肿瘤相关性最高的基因，其变异与许多癌症发生有关，包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌等[31,32]。在乳腺癌患者中，遗传因素导致的TP53突变极少(约占1%)，而体细胞的突变更为常见(约占20%～40%)[20]。BRCA1和BRCA2都属于抑癌基因，分别位于人体的第17号和第13号染色体上，在参与DNA损伤修复、维持细胞正常生长方面具有重要作用。如果这2个基因发生了突变，那么它们所具有的肿瘤抑制功能和对细胞增殖分化的控制能力就会受到影响，癌变的概率将明显增加[21,22]。已发现的BRCA1/2的突变有数百种之多，并与乳腺癌和卵巢癌，乃至男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的发生都密切相关，BRCA1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%～85%和15%～45%；BRCA2基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%～85%和10%～20%[33]。因此，BRCA1/2基因检测对于乳腺癌和卵巢癌的患病风险评估及早期诊断都有重要意义。PALB2基因被认为是继BRCA1/2基因之后的第3个乳腺癌关键基因，携带PALB2突变基因的女性，发生乳腺癌的风险在40岁以下人群中增加7～8倍，在40～60岁人群中增加5～7倍，在60岁以上人群中增加4倍[23]。PALB2基因的编码蛋白是抑癌基因BRCA2向细胞核内转移定位及核内稳定的协同因子，在保持基因组稳定和调节细胞周期过程中起重要作用。当BRCA2发生错义突变时会干扰PALB2蛋白的结合，从而使BRCA2失去DNA修复的能力[34]。三、第二代测序(next-generation sequencing，NGS)与乳腺癌易感基因检测大约24%的遗传性乳腺癌或卵巢癌患者的家庭成员中能发现BRCA1/2基因突变，而在同时拥有1例乳腺癌患者和1例卵巢癌患者的家庭中，BRCA1/2基因突变的频率则高达41.6%[35]。但仍有很多其他基因突变可能导致乳腺癌的发生，在乳腺癌筛查中仅检测BRCA1/2基因突变是不够的。从另一方面而言，尽管多个乳腺癌易感基因都已经被鉴定，但是这些基因中的任何1个突变都是罕见且因人而异的，如果用常规方法每次检测1个基因既低效又昂贵，NGS时代的到来为解决这个难题提供了可能。NGS与Sanger测序(即第一代测序)技术都是基于边合成边测序或边连接边测序的原理，但与后者相比，NGS具有通量大、精确度高和信息量丰富等优点，可以在较短时间内对感兴趣的基因进行精确定位，可以对未知的序列进行检测，也可以对某组织在某一时间表达的mRNA进行测序。NGS主要包括全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)、全外显子组测序(whole-exome sequencing, WES)以及目标区域测序(targeted region sequencing，TRS)[36]。以高通量为特点的NGS技术在后基因组时代蓬勃发展，有力地支持了肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)等多个肿瘤基因组项目的实施。目前，NGS已在无创产前筛查、肿瘤基因检测、遗传性疾病诊断、用药指导、复发监测等多个临床领域得到广泛应用[37,38]。以肿瘤的基因检测为例，基于NGS技术，未来的癌症治疗将实现对全外显子组的3 000多个基因进行全信号通路检测，从而可根据导致疾病的潜在分子及相关因子对疾病进行诊断和分类，这也使得”同病异治”和”异病同治”的精准医学模式成为可能[39]。以乳腺癌为例，癌症基因组图谱已测定了510个乳腺癌外显子组序列，并将其分为5个内源性亚型：luminal A型、luminal B型、正常乳腺样型、HER-2过表达型和基底细胞样型[40,41]。针对不同分型的乳腺癌可采用不同的治疗方案。随着NGS技术的飞速发展，在普通人群中进行NGS检测的费用不断下降。曾有研究利用NGS对有肿瘤家族史的人群进行肿瘤基因检测，结果显示检测肿瘤细胞中BRCA1/2及TP53基因的特异度和敏感度均高于传统检测方法[42]。由于乳腺癌的发生、发展与多个基因密切相关，基于NGS的遗传性乳腺癌基因集合(gene panel)检测在肿瘤风险预测及早期诊断方面更有价值。Tung等[43]采用NGS技术检测了25种肿瘤易感基因(包含了BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDH1、CHEK2、NBN、PALB2、PTEN、STK11、TP53这12种与乳腺癌直接相关的基因)，证实了仅仅基于BRCA1/2的突变分析并不能预测其他乳腺癌/卵巢癌易感基因突变所引发的致癌风险。Kraus等[44]也利用NGS技术同时检测14种已知的乳腺癌/卵巢癌易感基因(BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、PALB2、RAD51C、RAD51D、NBN、CDH1、TP53、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)，入组581例家族性乳腺癌患者，并在其中105例患者(18%)的10种基因中发现了106处有害突变，其中16处有害突变(15%)为首次发现；新发现突变中只有6处突变与BRCA1/2基因相关，新发现的6处PALB2基因有害突变中5处突变都与早发型乳腺癌及家族史呈正相关；此外还发现了89处暂未确定意义的新突变。这些结果都显示了临床肿瘤诊断对综合突变体数据库的需求，NGS能凭借高通量、高精确度的巨大优势，发挥更为关键的作用。四、基于NGS技术的乳腺癌液体活组织检查随着分子诊断技术的不断发展，分子分型在个体化治疗中的重要性日益提高，但无论是乳腺癌确诊还是分子分型指导下的个体化治疗，均需要采集组织标本。然而肿瘤组织取材具有明显的局限性，比如检测次数受限、不能动态监测肿瘤状况、肿瘤异质性使得活组织检查(简称活检)结果存在偏差、取材欠缺标准等[45]。因此，引入新型液体活检(liquid biopsy)技术，对提高乳腺癌诊疗水平具有重要意义。新一代液体活检相较于传统的组织活检具有操作简便、可重复性好、非侵入性等优势。液体活检的主要检测对象包括肿瘤标志物、HER-2蛋白胞外结构域(extracellular domain, ECD)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)等。肿瘤标志物检测基本已成为常规的临床应用，但特异性有待提高；CTCs和ctDNA检测则是近几年新兴的检测方法[45]。ctDNA存在于外周血中，是肿瘤细胞释放到血浆中的单链或双链DNA，其片段大小一般介于160～180 bp之间，半衰期一般不超过2 h，明显短于蛋白等血液学肿瘤标志物。ctDNA具有片段化、低含量、易降解等特点，但却携带有与肿瘤组织一致的分子遗传信息，比如肿瘤相关单核苷酸变异(single nucleotide variants, SNVs)、拷贝数变化(copy number alterations, CNAs)及结构变异(structural variants, SVs)等，可利用这些特点对乳腺癌患者ctDNA进行鉴定[46]。TP53、PIK3CA和ESR1基因的点突变就是乳腺癌ctDNA中较为常见的突变类型[47]。如能将ctDNA检测与NGS技术有效结合，可为乳腺癌患者诊断提供一种无创、实时的新手段[48]。基于NGS的ctDNA检测方法主要通过选定十几到几十种乳腺癌相关基因，对外周血ctDNA进行测序，根据富集这些相关基因的不同策略又可分为靶向扩增子测序(targeted amplicon sequencing, TAS)与目标序列捕获测序(targeted capture sequencing, TCS)。该技术能检测出新突变位点且检测基因数量不受限制，但也存在检测成本高且技术难度大等缺点，其技术完善尚需时日，应根据临床实际情况甄别性地使用[49]。五、NGS与乳腺癌伴随诊断同病同治的传统治疗策略已无法满足目前的临床治疗需求，个体化医疗和靶向治疗已成大势所趋。作为与靶向药物相关联的诊断技术——”伴随诊断(companion diagnostics, CD)”应孕而生。该技术不仅可以帮助医师制定更有效的治疗方案，还能够提供患者对某特定治疗药物的治疗反应信息，有助于确定能够从某一治疗药物中获益的患者群体，并提高对应药物在使用过程中的安全性和有效性[50]。目前，美国FDA已批准数个指导临床用药预期的NGS产品上市，即面向CD的NGS产品[51]，其中备受瞩目的是Foundation Medicine公司的FoundationOne CD(F1CD)。该产品通过对实体瘤患者组织标本的DNA测序，来确定基因突变，F1CD能检测实体瘤中的324种基因突变(包括4种突变类型：碱基置换突变、移码突变、插入突变和缺失突变)，同时还能报告特定的分子变化(微卫星不稳定状态与肿瘤突变负荷)[52]。F1CD检测的准确率高达94.6%，在非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌以及卵巢癌患者中，它还能找出哪些患者可以从美国FDA已批准的15种靶向治疗中受益。这将帮助医师在一次检测中观察到所有信息，无需重复活检或检测，很好地发挥了NGS高通量、高精确度的巨大优势，被誉为里程碑式的重大突破[52]。中国药品监督管理局也刚刚批准了厦门艾德生物医药科技股份有限公司的人类10基因突变联合检测试剂盒(维惠健)，它可用于定性检测非小细胞肺癌、结直肠癌患者的EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER-2、MET基因变异，这也是目前首款获批的跨癌种NGS伴随诊断产品[53]。目前主要的CD肿瘤标志物有HER-2、EGFR等，但就乳腺癌而言，BRCA基因突变无疑是最受关注的肿瘤标志物。2016年Foundation Medicine公司的FoundationFocus™ CDxBRCA获批，可用于携带BRCA致病突变(同时包括胚系和体系突变)卵巢癌患者的诊断及治疗，由于BRCA1/2基因的突变没有明显的热点突变而且还有多种突变类型，除了常见的SNV，基因组的某个位置上发生的小片段序列的插入或删除，还包括基因大片段重排(large rearrangement，LR)这样外显子水平的结构变异，常规的第一代测序方法并不能涵盖以上多种突变类型，而NGS检测则可以检测BRCA基因的全部外显子，并通过生物信息学算法完成对各种突变类型的分析[54]。此外，美国FDA还扩大了Myriad Genetics公司的伴随诊断检测产品BRAC Analysis CD的适用范围，它可通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)和Sanger测序检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和小片段的插入和缺失，用多重PCR检测乳腺癌与卵巢癌患者血液样本中的BRCA1和BRCA2基因大片段缺失和拷贝数变异，从而确定患者是否具有遗传性BRCA突变，并可筛选出最有可能从多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)抑制剂利普卓(lynparza)治疗中受益的患者[55]。美国FDA对BRAC Analysis CD适用范围的进一步扩大，使学者们看到了伴随诊断为乳腺癌精准治疗带来的巨大希望，但值得注意的是，目前市场上仍缺乏专门针对乳腺癌的NGS类CD检测产品。六、结语通过NGS解析基因序列的变异对乳腺癌的诊断、预后和治疗都具有重要作用，已有基于NGS技术对三阴性乳腺癌患者和ER阳性乳腺癌患者进行RNA测序和DNA测序[56,57]，这些研究结果极大地推动了乳腺癌基因组学的进展。此外，通过NGS还发现了一些除BRCA1/2以外的乳腺癌易感基因[58]。然而，NGS作为一种新技术还存在不少问题。比如，NGS的测序结果对于患者或临床医师是没有意义的，需要经过病理分析师将测序结果转化为临床可以参考的结果[59]。因此这类产品的安全性、有效性不仅要考虑产品的测序性能，同样要考虑测序结果解读导致误判的风险。此外，鉴于大健康概念所蕴含的巨大商机，很多商业性基因测序服务机构都开展了NGS基因检测服务，但是基因检测服务提供方良莠不齐，其检测质量难以得到保证。这些都需要统一的规范和严格的管理，否则对于NGS的应用推广将产生不利的影响。目前美国FDA等机构已对NGS的临床应用提出了一些指南和建议，涵盖了伦理、患者教育、生物信息数据处理、数据贮存及临床报告的多个环节[60]，这对于建立统一的质量控制标准来说是一个良好的开端。总而言之，基于NGS技术的乳腺癌基因诊断研究已经取得了很大的成果。但目前获批上市的NGS乳腺癌诊断试剂盒仍非常少，而且价格昂贵，且NGS的肿瘤诊断应用之路仍有不少问题需要解决。但可以预见的是，未来随着人类对乳腺癌及其他肿瘤发生、发展机制的深入认识，以及NGS技术的不断进步，精准医学所提出的个性化治疗终将成为可能。
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