众里寻它千百度，蓦然回首，绒绒毛霉在深处 —— 1例毛霉菌引起侵袭性真菌病的诊疗过

王楠1  张永利2 李士军1 肖晓光1 刘爽1 林琳11.大连医科大学附属第一医院检验科2.大连医科大学附属第一医院重症医学科01前  言侵袭性真菌病(invasivefungal disease,IFD)是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的感染性疾病。在重症患者及免疫抑制人群中具有较高的发病率和病死率[1],以念珠菌感染最常见，可达53%[2]，其次为曲霉、毛霉及隐球菌[3]。诊断标准由危险因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学检查四部分组成。本报道分享一例由毛霉菌感染引起的侵袭性真菌病的诊疗经过。02案例经过患者男性，45岁，既往体健，无不良个人史。2016年10月8日以“上腹部疼痛不适4年，加重2月”为主诉收住胃肠外科。入科前查胃镜示：胃体后壁及部分大弯侧、小弯侧见一溃疡型病变，大小约4.0cm，病理示胃癌。入科情况：体温36.5℃，心率70次/分，呼吸频率16次/分，血压130/80mmHg，查体未见异常。入院初步诊断：胃癌。患者入科后完善相关检查，行胸部CT（图1）示：左肺上叶舌段节段性炎症可能。结合腹部CT确诊为：1.进展期胃癌（ML.BorrmannIII.CT4NIMO）2.双肾结石。患者无手术禁忌症，于10月11日行腹腔镜下胃癌根治术Billroth-II消化道重建Braun吻合D2。术后予头孢米诺钠预防感染，患者一般情况良好。12日患者突发血压下降、神志不清，后心跳骤停，血压测不出，经心肺复苏，气管插管，肾上腺素及呼吸兴奋剂积极治疗后自主心率、血压恢复，呼吸仍然浅慢，考虑失血性休克，不除外肺栓塞可能，转入ICU重症监护治疗。患者转入ICU后处于深昏迷状态，四肢无自主活动。给予积极抗休克治疗。因患者腹部引流出红色不凝血，结合腹部B超，行剖腹探查术明确出血原因。为预防感染给予亚胺培南西司他丁1.0gQ8h静点，奥硝唑氯化钠100mLbid静点。微生物实验室相关检查：痰培养示正常咽喉菌群生长、无真菌生长；腹水培养示无细菌、真菌生长；血培养示无细菌、真菌生长。胸部X线（图2A）示：双肺纹理增强。因患者代谢紊乱于10月13日开始间断CRRT治疗。10月14日患者实验室检查：WBC 24.26×109/L，中性粒细胞比例87%，痰培养示正常咽喉菌群生长。GM试验、G试验均正常。床旁X线（图2B）示：双肺纹理增强、模糊，肺部感染明确存在。因肝肾功能异常亚胺培南西司他丁减量至0.5gQ6h静点。结合相关检查汇报给予对症支持治疗。10月16日实验室检查：WBC 33.35×109/L，中性粒细胞百分比87.80%，提示感染严重。加用万古霉素1.0gbid静点抗感染治疗，监测万古霉素血药浓度。10月17日行床旁电子支气管镜（镜下可见气管内、隆突上方气道黏膜弥漫性分布较多斑片状、灰黑色板块，上覆绒毛状物），取灰黑色物培养示毛霉菌生长（图5-6）。支气管镜送检病理提示：霉菌生长（图3）。痰培养示：毛霉菌生长。针对毛霉菌给予两性霉素B治疗，5%葡萄糖50mL+5mg两性霉素B以2.5mL/h泵入，监测肝肾功能。尿培养示：鲍曼不动杆菌（MDR）。床旁胸部X线片（图2C）示：双肺纹理紊乱、模糊，右肺下野可见斑片影；左肺透过度减低，心影增大，肋膈角模糊。患者肺部感染加重。后续多次痰真菌培养均示毛霉菌生长。10月22日患者痰细菌培养示肺炎克雷伯杆菌生长，药敏结果提示MDR，停用亚胺培南西司他丁、万古霉素。血培养：无细菌、真菌生长，胸部X线片（图2D）示：双肺纹理稍紊乱、模糊，双肺斑片影。11月3日痰培养回报肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌生长，肺炎克雷伯菌药敏同前，针对产气肠杆菌加用敏感药物左氧氟沙星。患者胸部X线（图2E）示：双肺纹理紊乱、模糊，双肺可见多发斑片状高密度影。11月6日患者由于病情危重，多脏器功能衰竭，抢救无效去世。03临床案例分析患者术后为什么会出现失血性休克？本例患者既往体健，入院后体格检查、血尿便常规、肝肾功、凝血、电解质等均未见异常，术前检查无手术禁忌症，根据患者各项检查评估患者肿瘤分期，行腹腔镜下胃癌根治术Billroth-II消化道重建Braun吻合D2。术中探查无活动性出血，术后患者体温36.0℃，脉搏86次/分，血压150/90mmHg，血氧饱和度100%。右肝下引流出50mL浆血性液体，胃肠减压引出褐色液体约10mL。术后为补充凝血因子，输410mL血浆；术后12小时左右，患者突然血压下降，心率增快，呼吸浅慢，右侧肝下引流出150mL血性液体，腹部膨隆，叩诊浊音，行腹部彩超及腹部穿刺抽出不凝血；剖腹探查发现腹腔内出血伴血凝块，量约2500mL。胃癌术后出血包括腹腔内出血和消化道出血；本例患者胃肠引流未见血性液体，排除消化道出血，考虑腹腔内出血，剖腹探查也验证了这一点。但剖腹探查示肝胆胰脾未见异常，胃周血管未见活动性大出血，胃肠吻合口、肠肠吻合口未见活动性出血，术后置4枚引流管引流。后期检查患者凝血功能异常、血小板减少，间断给予输血浆、冷沉淀凝血因子，引流出的血性液体逐渐减少。综上患者腹腔内出血可能是由于凝血功能障碍导致的出血，不排除未探查到的隐性出血。感染毛霉菌是加速患者死亡的催化剂吗？本例患者入院后因失血性休克，导致深昏迷，无自主活动及呼吸，持续呼吸机辅助通气中，无法自主进食，一直靠肠外营养维持，并且长期应用糖皮质激素，多种因素导致患者抵抗力下降，为感染毛霉菌提供了自身条件。毛霉菌进入易感者呼吸道后，菌丝可以穿透小支气管壁，侵袭血管壁和血管腔，形成血栓和栓塞，导致组织缺血、出血性梗塞和坏死性炎症。毛霉菌引起的肺部感染，临床可以表现为非特异性肺炎，引起患者肺部炎症改变，本病例患者X线变化（图2）可见双肺纹理从增强到紊乱、模糊最后呈斑片影，逐渐加重。肺部的毛霉菌病，临床表现一般为持续高热。但是，该患者体温一直不高，推测可能与患者一直间断进行CRRT治疗有关。患者感染症状一直都存在，白细胞及中性粒细胞百分比始终都处于高位状态（图4）。患者痰培养确诊毛霉菌感染后，根据2013年ESCMID/ECMM联合临床指南[4]、2015ECIL-6(欧洲白血病感染会议)指南[5]、2016台湾应用抗真菌药治疗侵袭性真菌病指南[6]，治疗方案均推荐两性霉素B、泊沙康唑或手术治疗。本病例结合指南及临床用药经验给予了两性霉素B治疗，但是患者用药后痰培养持续出现毛霉菌感染。推测其原因其一是毛霉目对两性霉素B存在着较为明显的种间和种内差异，部分菌株可对两性霉素B呈现耐药。其二由于毛霉菌可引起血管栓塞、周围组织梗死，使药物不能有效到达病变组织而经常导致治疗效果不如人意。据国外报道未经治疗者病死率为80%，病变局限于肺部者为65%，播散型高达96%。患者后期各项指标变化支持毛霉感染加速了患者死亡。04检验案例分析实验室如何诊断致死率居高不下的毛霉病？01组织病理学怀疑毛霉病的临床标本，首选荧光染色直接镜检。组织病理切片HE、PAS或银染色，见透明菌丝，宽度6～16μm, 最宽达25μm,无隔或少隔，可呈垂直及不规则分枝。毛霉菌在组织中典型表现为90°角分枝，但由于加工机械力可出现45°分角，有时很难与曲霉鉴别。鉴此，宽菌丝和不规则分枝特点比菌丝分隔和分枝角度更为可靠。毛霉病的组织病理有一定特征性，但不具有特异性，既可在急性病变中见出血性坏死、血管侵袭、嗜中性粒细胞浸润和周围神经侵袭改变，也可在慢性病程呈巨细胞参与的慢性肉芽肿性改变。本病例患者的支气管镜吸取物送病理（图3），结果提示：大量霉菌生长。怀疑因吸取物较少，取材受限，未能检测到菌丝。02微生物培养与镜检——强烈推荐欧洲医学真菌学联合会强烈推荐标本培养，以进行属和种鉴定及抗真菌药敏试验。培养前应避免组织过度研磨，并强烈推荐在30℃和37°C孵育。强烈推荐使用荧光染色对临床标本进行直接镜检，关注分隔、分枝角度和菌丝宽度。本实验室取支气管镜吸取物马上进行培养鉴定，接种在BA与SDA培养基25-30℃下培养，发现菌落生长迅速，菌丝体蔓延，菌落呈疏松棉花样，高度约为1cm。菌落顶端有黑色小点，背面呈白色(图5)，初步怀疑为毛霉菌生长。将菌落进行乳酸酚棉兰、六胺银与荧光染色（图6），显微镜下观察形态特征。发现菌丝宽大，壁薄，不分隔，分支近直角，孢囊梗直接从菌丝体长出，孢子囊在孢囊梗顶端，孢子囊呈球形，黄褐色，释放出大量的孢子，孢子球形，壁薄光滑。提示为毛霉菌生长。03病原菌的分子学鉴定相对于形态学鉴定，分子生物学方法对于病原体种属分类可信度更高。完善的种属鉴定对于区域性的高危人群的发病预防及暴发流行应对都有很高的医学价值。因此，分子学鉴定在毛霉病的诊疗中的地位与价值必须受到重视。毛霉目中不同属真菌鉴定及分类学研究进展不一，但目前内转录间隔区ITS序列及28S核糖体亚基序列，即可对毛霉目真菌进行很好的种属鉴定，种属鉴定率可达98%以上，足以满足临床鉴定需要。近些年，随着实验室检验技术的发展，非传统的种属鉴定技术也逐渐开始应用，最具代表性为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOFMS)，随着该技术数据库的完善，对于毛霉病致病真菌准确的种属鉴定率已经可达到95%以上，体现出了良好的应用前景。此外，随着第三代数字PCR技术的逐渐推广，基于数字PCR技术的毛霉菌病的鉴定具有广阔的应用和发展前景。现今，国内外对于部分真菌感染开展的三代PCR检测技术已经体现出了高敏感性、高特异性的诊断价值。05知识拓展1. 肺毛霉病与侵袭性肺曲霉病（IPA）的鉴别诊断 临床工作中，肺毛霉病与侵袭性肺曲霉病难以鉴别。肺曲霉病是由于感染或吸入曲霉菌属引起的一组急、慢性肺部疾病，因宿主免疫状态不同而有不同表现。免疫功能受损者易感染，常见类型有IPA、慢性坏死性肺曲霉病、慢性肺曲霉病、过敏性支气管肺曲霉病。IPA多发生在原有肺部慢性病或严重基础疾病的基础上，特别是应用大量糖皮质激素或免疫抑制剂的情况下，因人体免疫功能低下而引起感染。IPA的基本病理特征是化脓和梗死；病理组织切片可见菌丝和孢子经HE染色呈蓝灰色，略带红色背景，而PAS及嗜银染色分别呈红色和黑色。菌丝长短不一，多呈杆状，有分隔，直径为3~5μm，并见多条菌丝沿同一方向反复分支，分支呈45°角，呈放射状或珊瑚状排列 [7]。临床表现不一，并缺乏特征性，临床表现常与患者白细胞的数量和功能异常的程度有关。胸部CT可发现特征性的改变，疾病早期（约1周内）CT可见晕轮征（halosign），即磨玻璃样环状阴影环绕病灶周围，因病灶周围水肿或出血所致；稍后（1周左右）可出现底边邻近胸膜、尖端朝向肺门的楔形阴影，与肺血栓栓塞症导致的肺梗死类似。空气新月征（crescentsign）出现较晚（2~3周左右），表现为原有病灶中出现新月状的低密度透光区，较常见于免疫抑制患者中性粒细胞恢复期，因梗死灶收缩所致。后期可在病灶内形成曲霉球。涂片显微镜检、真菌培养、组织病理学（深部真菌感染的金标准）、 抗原及其代谢物质检测共同协助对疾病进行诊断。治疗首选用药为伏立康唑。2. 血清学检查，有效还是鸡肋？GM试验是诊断曲霉菌的检测方法之一，而毛霉菌感染GM试验常为阴性。当患者临床怀疑真菌感染，而反复GM试验阴性时应警惕毛霉菌感染可能，本例患者即为多次GM实验均为阴性。但当GM试验为阳性时，也不能完全排除毛霉菌感染可能，应警惕曲霉菌和毛霉菌合并感染的可能。可行支气管灌洗及痰液培养，必要时行肺组织穿刺活检明确诊断。肺组织活检是诊断毛霉菌感染的金标准，但由于为侵入性检查，可操作性差，易发生气胸、肺出血等并发症，常不被患者接受。近年来，随着分子生物技术的发展，宏基因组测序在临床得到了广泛应用，通过检测血清样本中毛霉菌DNA可实现毛霉菌感染的早期诊断。3. 毛霉菌临床感染日益增多毛霉菌病又称接合菌病，是一种较为罕见的真菌病。毛霉菌广泛存在于自然界，是一种条件致病菌，最常侵犯鼻窦，其他部位亦可累及。临床分5型，即鼻脑型、肺型、胃肠型、播散型、混合型，其中以鼻脑型和肺型最常见。肺毛霉病好发于有基础疾病者，如糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、肺恶性肿瘤、应用免疫抑制剂患者。20世纪中期，糖尿病逐渐成为毛霉病的主要危险因素。近年来，化疗或免疫抑制剂的应用、潜在的恶性淋巴细胞肿瘤等也成为了毛霉病的重要危险因素。如随着实体器官和造血干细胞移植(HSCT)的开展，术后免疫抑制剂的大量使用，在这些患者群体中相关病例报道逐年增多。国内因缺少关于毛霉菌病的相关报道及多中心研究，因此尚未见到相关流行病学报告，但就目前为数不多的案例报道来看，免疫缺陷、恶性肿瘤及糖尿病为我国常见的易感因素。06案例总结本案例患者入院前生命体征平稳，查体未见异常，术后出现失血性休克导致深昏迷，无自主呼吸。针对患者症状积极对症支持治疗，对术后可能出现的感染给予亚胺培南西司他丁、奥硝唑预防；后期白细胞、中性粒比例及胸部X片提示感染加重，加用万古霉素；随后痰细菌和真菌培养明确了感染，细菌药敏试验指导了用药，即停用亚胺培南西司他丁和万古霉素，加用左氧氟沙星，对痰培养出的毛霉菌进行了药敏试验，结合临床指南和用药经验给予了两性霉素B，但用药效果不理想，最终患者多器官衰竭死亡。该患者转入ICU重症监护后为更好的治疗，多次进行多学科会诊，并多次进行体外培养以明确感染病因，指导临床用药。毛霉菌感染是一种致命的临床真菌感染，目前临床用药选择范围受限，部分菌株可对两性霉素B呈现耐药。毛霉菌本身又可引起血管栓塞、周围组织梗死，使药物不能有效到达病变组织而经常导致治疗效果差强人意。重症患者由于各种原因最容易成为细菌和真菌感染的易感人群，如何预防感染、更早的发现感染以及感染后精准用药是临床医生面临的重要挑战。本案例患者的临床诊断及治疗可以为今后临床医生的治疗提供参照。07专家点评肺毛霉菌病在国内报道不多，是一个医疗紧急情况，需要及时诊治，更需要多学科配合。治疗成功的关键在于早发现、早诊断、去除危险因素、控制基础疾病、早期清除坏死组织和早期应用抗真菌药。但由于肺毛霉菌病临床表现和影像表现缺乏特异性、真菌抗原检测如G试验、GM试验等均为阴性、真菌培养阳性率低，故临床早期诊断常较困难。我国人口众多，医学进步显著，器官移植及糖尿病患者增长迅速，毛霉菌感染人数势必增加，应注意到严峻性所在，值得临床相关科室高度警惕。呼吁卫生管理部门推进在我国三级甲等医院设立由相关感染科、检验科、影像科专家及真菌病专家组成的真菌病诊治指导小组，针对复杂真菌感染(如毛霉病等)，应多学科协作，科学精准地制定诊疗方案，以提高疑难复杂或危重真菌病患者的救治率或治愈率。期待半衰期长、组织浓度高、不良反应少，且价格适合我国国情的治疗毛霉菌的药物早日应用临床。参考文献：[1] MarionBlaize, Julien 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