免疫组化的致命陷阱——真实的谎言

免疫组化的致命陷阱 —— 真实的谎言3月不讲一点质量控制方面的问题似乎对不起315。免疫组化的质量控制离不开三个方面：1、厂家；2、技术员；3、病理医生。试剂及设备厂家提供高质量敏感的试剂、稳定的设备，技术员严格按照SOP文件进行免疫组化染色，病理医生精准的质量评判，每个环节各司其职，发现问题，依照PDCA循环解决问题，共同维护免疫组化染色体系的稳定及准确性，为病理诊断保驾护航，确保病理诊断的精准。在这个过程中，建立了各种质量体系，包括质量认证，SOP文件，对照体系，室间质控，室间比对等，理论上，严格执行各种质控措施，就能最大程度上避免免疫组化染色的质量所导致的陷阱。理想很丰满，现实很残酷，日常工作中各种免疫组化质量问题层出不穷，包括厂家设备及试剂质量问题，技术员操作问题及医生的判读问题，这些问题的出现，极大影响了病理诊断的准确性，就连实验室检查互认也不可能实现。病 例女性，57岁，胃及小肠占位小肠，肿瘤累及全层黏膜下层的肿瘤细胞较黏膜层成熟小淋巴细胞大，细胞明显收缩，评估细胞具体大小困难靠近浆膜面肿瘤细胞形态，呈现大细胞形态，综合黏膜面及浆膜面肿瘤细胞形态改变，可以推断出手术标本未能及时切开，固定时间不充分。浆膜面固定较好，肿瘤细胞形态保存良好，便于形态评估，黏膜面因肠管未能及时切开而固定不及时（延迟固定）并取材制片（固定不足），在组织脱水过程中出现收缩，从而影响细胞形态的观察。CD5，肿瘤细胞阴性，散在反应性T作为内对照CD20阴性，一个阳性细胞也没有CD20的外对照——扁桃体，提示CD20染色成功CD19的染色，提示肿瘤为B细胞性，尽管组织固定欠佳，不存在抗原丢失CD38，肿瘤细胞阴性，形态及免疫表型不支持肿瘤具有浆细胞分化或浆母细胞免疫表型结合形态及免疫表型，本病例为大B细胞淋巴瘤，但是CD20阴性，不具备浆母细胞形态及免疫表型，所以还是考虑弥漫大B细胞淋巴瘤。CD20阴性的弥漫大B细胞淋巴瘤相对少见，多见于美罗华治疗后，本病例为新发病例，排除了治疗后改变。CD20染色切片中外对照阳性，提示染色成功，但是待检组织中一个阳性信号也没有，不符合常理。CD20的染色质量不言而喻，不仅仅用于诊断分类， CD20还是重要的治疗靶点，使用利妥昔单抗大幅提高了弥漫大B细胞淋巴瘤患者的治愈率。非霍奇金B细胞淋巴瘤CD20阴性，意味着患者不能使用利妥昔单抗进行治疗，降低了治疗效果，甚至因此治疗失败。鉴于CD20结果的重要性和CD20染色结果的疑虑，决定换平台检测CD20（这个费用不需要患者买单，但是总需要人来买单）！换用另外检测平台检测CD20，显示弥漫阳性肿瘤细胞弥漫阳性，切片较厚黏膜内淋巴组织，可能为淋巴管内肿瘤细胞两个平台的肉眼观察对比左边是我们日常使用的平台（就称为A平台），因为CD20是三类证抗体，与靶向治疗相关，所以我们日常选择这个平台，该平台的CD20通过了认证；右边是重复所使用的平台（就称为B平台），淋巴瘤诊断相关的抗体我绝大部分使用该平台。大块组织为肿瘤待检组织，小块组织为外对照，两个平台的外对照染色均成功。重复结果可以证实A平台此次染色结果出现了问题，如果在该平台重复CD20会是什么结果？A平台重复CD20，这次染色成功A平台重复CD20，这次染色成功从左至右依次为A平台原始CD20染色，A平台重复CD20染色，B平台重复CD20染色。A平台有一些缺陷，最常见是染成白板（对照与待检组织均阴性），厂家提示泡牛奶，貌似解决了一部分问题。但是像这次一张切片中，外对照染色成功，待检组织染色失败的案例罕见，但绝不是孤例（以前我也曾经发现过，只是没有分享出来）。对于CD20这种有内对照的免疫组化标记，发现假阴性相对容易，而那些缺乏内对照的标记，则几乎不可能识别假阴性。如果标记与诊断或治疗密切相关，这种标记的假阴性可能是致命的，因为对照显示染色成功，实际的待检组织染色失败。A平台的这种缺陷，我认为与A平台的专利技术有关，高大上的专利技术比较挑免疫白片的质量，国产的免疫胶片几乎就不适合用于A平台。在我的会诊过程中，接受的免疫白片几乎就没有使用国外品牌（绝对不是崇洋媚外，要认识到技术的差距）的免疫胶片。所以我习惯向原单位索要蜡块（用原单位的免疫白片可以减少我们的成本！使用蜡块会增加我们的成本），大多数病理科会满足我的要求，当然也会遇到不理解的单位。有一家单位说：潘老师，你想要什么样的切片，要多少，有什么样的技术要求，我们都满足，就是蜡块不能借！所以我做了一个小小测试，叫患者带上我们的免疫胶片去原单位切白片，对比两次使用不同免疫胶片的白片染色效果。这是两次ALK染色对比，使用ALK（D5F3）。上面两幅图是外院免疫胶片，左侧为外对照（炎性肌纤维母细胞瘤），右侧为待检组织肺腺癌；下方两幅图是使用了我院免疫胶片，原单位切的白片，左侧为外对照（与上图为同一组织），右侧为待检组织肺腺癌。两次检测使用同一平台及同一染色程序，但是染色效果完全不同。免疫胶片对于染色质量的影响不仅仅局限于A平台，实际上所有平台都会受影响，只不过A平台受影响最为严重，这与其使用的混匀技术有关。尽管A平台用浸泡指定品牌牛奶降低了免疫胶片质量的影响，但是不等于完全解决了问题，比如这次出现的极端事件。这次染色出现外对照染色成功，而待检组织染色失败，我认为主要原因是免疫胶片的质量问题，外对照为我院切片，待检组织为原单位切片，两次捞片过程，可能在玻片上形成了一层油膜样物质，阻碍了试剂与待检组织的接触。这可能与煎鱼防止粘锅有相似之处，煎鱼的时候烧少许热油，倒出热油加冷油，就会在锅底形成一层油膜，煎鱼的时候就不会粘锅。只不过这种故意形成油膜每次都成功，而A平台的这种现象有一点像段誉的六脉神剑，时灵时不灵。这次发现问题是幸运的，因为CD20有内对照，可以判断染色失败与否，对于那些没有内对照的标记，如何才能避免这种隐形的染色失败？希望试剂厂商、耗材生产商能够提出切实的解决办法。
（责任编辑：dawenwu）