室温下罕见凝胶状EDTA抗凝血的多发性骨髓瘤合并冷球蛋白血症案例分享

作者 | 毛志刚1，代阳2单位 | 四川大学华西医院：1实验医学科2.血液科前  言冷球蛋白是血清中存在的单一或混合免疫球蛋白，低于37℃这种蛋白可沉淀，高于该温度可再溶解。当血中冷球蛋白增高(>25mg/mL)可引起冷球蛋白血症。冷球蛋白血症分为原发性和继发性，以后者居多，约占60-75%。1974年Brouet将冷球蛋白血症分为三型：I型为单克隆免疫球蛋白，多数为IgM或IgG，较少见IgA和Bence-Jone蛋白;II型为含一种单克隆球蛋白的混合型冷球蛋白，由多克隆IgG和单克隆的具有类风湿因子(RF)活性的IgM组成;Ⅲ型则为单克隆成分IgM和单克隆的IgG。II和III型又称为混合性冷球蛋白(MC)。单克隆冷球蛋白(I型)多见于血液系统疾病，而混合性冷球蛋白(MC)常与慢性感染性疾病如EB病毒、丙型肝炎病毒、自身免疫性疾病、B淋巴细胞增生性疾病如非霍奇金淋巴瘤(NHL)相关。多发性骨髓瘤是以恶性浆细胞在骨髓克隆性增殖为特征的血液肿瘤，导致贫血和相关的全血细胞减少、低丙种球蛋白血症、溶骨性骨病、高钙血症和肾功能不全。临床症状由肿块压迫，或是骨髓瘤细胞、骨髓基质细胞或骨细胞释放的细胞因子造成的影响，以及骨髓瘤蛋白沉积在靶器官上引起淀粉样轻链蛋白变性和轻链蛋白沉积病。多表现为骨痛(脊柱，胸部，不常见四肢长骨)，虚弱疲劳，贫血，体重减轻等，但当患者没有典型的临床症状时容易造成漏诊。本病例从不合格血常规标本的多次拒收经历开始，顺藤摸瓜，结合现有病史发现冷球蛋白血症，继而诊断出多发性骨髓瘤，最后通过临床医生的妙手回春最终使患者缓解出院。让我们一起回顾一下这个病例诊治过程的奇妙旅程吧!案例经过根据患者的主诉，入院后查体：全身可见散在密集紫癜，压之未见褪色，皮温不高，双侧小腿可见10×10cm皮肤溃疡，局部伴有黑色痂壳及肉芽组织形成。入院初步诊断紫癜;重度血管炎;双下肢皮肤溃疡伴感染。入院后辅助检查：TORCH、抗心磷脂抗体、DIC未见明显异常。T细胞亚群：CD3细胞亚群85.50%，CD8细胞亚群42.60%，CD4/CD8比值0.95。生化：总胆红素4.2umol/L，谷氨酰转肽酶75
IU/L，总蛋白55.8g/L，白蛋白24.3g/L，白球比例0.77，甘油三酯2.12mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇0.74mmol/L，肌酸激酶15
IU/L。B型钠尿肽前体2079ng/L，肌钙蛋白-T
14.4ng/L。肿瘤标志物及降钙素原检测：血清糖类抗原125
50.70U/mL，降钙素原0.17ng/mL，抗环瓜氨酸肽抗体42.20U/mL。常规检查未发现明显异常，入院后积极治疗皮肤溃疡，寻找病因。根据反馈结果等待进一步诊疗。案例分析检验案例分析这个患者入院后送检血常规，发现血红蛋白和红细胞计数同时升高，表现为：RBC
9.49×10^9/L，HGB
251 g/L，MCH
26.4 pg，MCHC
317
g/L。看到此结果报告审核人员第一感觉是该患者红细胞增多或者来源于高原地区。核对病史后排除高原地区来源，检查标本性状时发现此标本倒立时血浆和血细胞分离，血细胞黏附于采血管壁(如图1所示)。图1 标本倒立后血浆和细胞分离，血细胞黏附于采血管壁，疑似凝块根据经验肉眼判断为：血液凝固，按不合格标本处理，建议重新采集后送检。该患者在住院期间未明确诊断时共送检6次血常规，其中3次被判断为不合格标本，另外三次其结果为(1).
RBC 3.33×10^9/L，HGB
91 g/L，MCH
27.3 pg，MCHC
323 g/L。(2).
RBC 3.05×10^9/L，HGB
82 g/L，MCH
26.9 pg，MCHC
318 g/L。(3).
RBC 3.07×10^9/L，HGB
83 g/L，MCH
27 pg，MCHC
316 g/L，均按正常标本模式发放报告。但在第7次报告审核过程中发现该患者WBC分类散点图异常(如图2所示)，从WDF散点图中发现：其蓝色的破碎细胞区域散点明显增多，并且其荧光强度增强，部分破碎细胞被仪器误认为嗜酸性粒细胞，仪器嗜酸性粒细胞计数结果为12.4%。图2 WBC分类计数中WDF和WNR通道散点图散点图异常触发我室复检规则，涂片镜检后发现：DI-60血涂片阅片仪嗜酸性粒细胞计数结果为0.8%，证明血细胞分析仪嗜酸性粒细胞为假性增高(12.4%)。但在镜检过程中又有新的发现：大量中性粒细胞其形态异常(如图3所示)，初步观察表现为中性粒细胞空泡增多。图3.DI-60阅片仪扫描细胞形态：中性分叶粒细胞形态异常，存在大量空泡和疑似球形蛋白结晶;嗜酸性粒细胞比例低(分类结果为人工确认后结果)，仅占0.8%。仔细观察并不完全为空泡，部分内含物形态为淡蓝色圆球形结晶，疑似冷球蛋白结晶(如图3所示)。然后将该血涂片重新显微镜镜检(如图4所示)发现：中性粒细胞吞噬有大量淡蓝色蛋白结晶，同时还可见杆状淡蓝色结晶。结合日常工作经验考虑为冷球蛋白结晶。图4.显微镜下多视野观察及图象采集结果，胞浆内含淡蓝色球形蛋白结晶，血浆中存在棒状结晶为了验证此猜想，将标本放置37℃孵箱中孵育30min后重新测定血常规并涂片镜检(如图5所示)发现：血细胞计数结果发生改变，其结果为RBC 2.01×10^9/L，HGB
60 g/L，MCH
26.6pg，MCHC
310
g/L。AB图5.孵育前后比对，图A：左图为孵育前红细胞分布，右图为孵育后红细胞分布，可见孵育后红细胞聚集明显减轻，并且淡蓝色结晶状物质消失。图B：左图为孵育前WBC散点图，右图为孵育后WBC散点图，可见WDF散点图中蓝色破碎细胞区域散点明显减少。镜检发现红细胞不规则聚集完全消失，且淡蓝色不规则结晶完全消失。并且重新经过血细胞分析仪检测后发现此前RBC、HGB均假性增高。将该标本1500rpm离心10min后观察采血管标本发现(如图6所示)：介于血细胞层和血浆层之间存在絮状蛋白沉淀物。根据该患者送检血常规标本存在冷球蛋白结晶，积极联系该患者的主治医师，考虑冷球蛋白血症，建议送检“冷球蛋白检测”。通过与临床沟通后续送检的“冷球蛋白检测”，结果为阳性，证明该患者为冷球蛋白血症。图6.离心后观察可见：介于血细胞层和血浆层之间存在絮状蛋白沉淀物该标本镜检存在冷凝集现象(如图5A所示)，但与传统的冷凝集现象时RBC、HGB、MCH、MCHC结果存在差异。传统冷凝集结果多表现为RBC计数结果假性降低，HGB结果多正常，从而导致RBC计算参数MCH、MCHC假性增高，MCHC多大于365g/L。但本次病例中RBC计数和HGB浓度多成比例性升高或降低，最高时可达RBC
9.49×10^9/L，HGB
251 g/L，多次MCHC结果介于310
g/L~330
g/L之间波动，均未超过365g/L，与传统的冷球蛋白检测结果模式存在差异。会不会存在除了冷球蛋白之外，其他的因素干扰血常规检测结果呢?带着这个疑问，通过查阅资料后发现：冷球蛋白血症可伴随多种疾病并发，例如病毒感染、淋巴浆细胞异常增殖、自身免疫性疾病、患者起病多样，临床表现差异大[1，2]。为明确诊断该患者诊断，又与临床进行了第二次沟通，建议进行骨髓穿刺涂片学检查和骨髓细胞免疫学分型。骨髓涂片形态学发现异常：有核细胞增生活跃，粒红比为1.72：1。粒系占51.5%，红系占30%，形态未见明显异常。镜下查见浆细胞，以幼稚浆细胞为主占10.5%(如图7所示)，细胞大小不一，形态不整;胞核圆形或类圆形，偏位，核染色质疏松，核仁模糊可见，可见双核、畸形核浆细胞;胞质量较多，染深蓝色。图7.骨髓涂片中浆细胞形态其诊断意见为：目前骨髓形态学考虑多发性骨髓瘤，请结合临床及免疫学相关检查。骨髓流式免疫分型结果提示：FCM查见克隆性浆细胞，其比例为2.9%，限制性表达胞浆Kappa轻链，不表达Lambda轻链。生化结果提示：白蛋白24.3g/L，球蛋白31.53g/L，白球比例0.77，球蛋白不升高。血清蛋白电泳提示(如图8所示)：白蛋白45.20%，α1-球蛋白7.40%，α2-球蛋白17.00%，β2-球蛋白2.80%，γ-球蛋白20.50%，M蛋白15.9%，总蛋白56.5g/L。免疫固定电泳(如图9所示)：免疫球蛋白G
15g/L，免疫球蛋白A
364.00mg/L，免疫球蛋白M
378.00mg/L，KAP轻链14.70g/L，LAM轻链1.84g/L，血KAP/LAM比值7.99，IgG
KAP型M蛋白
阳性(+)。图8 血清蛋白电泳所示电泳条带，存在M蛋白条带图9.免疫固定电泳所示电泳条带，表现为Ig G Kappa型M蛋白最终该患者确诊为：多发性骨髓瘤，IgG
KAP型。后转入血液科继续治疗。通过对检验结果的疑问，最终明确了其诊断为多发性骨髓瘤的疾病诊断，但这并未能解释其RBC计数和HGB浓度成比例升高的问题，我们还需进一步查找原因。通过血、尿游离轻链蛋白的检测，血游离κ轻链1500mg/L，血游离λ轻链23.1mg/L，尿κ轻链1.39g/L，尿λ轻链<0.02g/L，血液中存在大量游离κ轻链蛋白。从而导致血液粘稠，血细胞和血浆不易分层，血液静置时红细胞不易沉淀，血常规上机时由于标本呈胶冻状，又无法充分混匀，从而导致RBC计数和HGB浓度成比例升高，并且静置放置时间越长，其致RBC计数和HGB浓度升高越明显。静置放置时间短对结果影响小，通过多次混匀和37℃孵育，可纠正轻链蛋白和冷球蛋白对血常规检验结果的影响，从而得到RBC计数和HGB浓度的准确结果。最终该患者RBC 2.01×10^9/L，HGB 60 g/L，MCH 26.6pg，MCHC 310 g/L。在孵育纠正之前，多次不合格标本的判断均为观察不仔细所致，在正常发放报告中RBC计数和HGB浓度的结果存在轻微假性升高的现象。临床案例分析从病史和前期的临床表现上看，该患者初期的入院诊断还是比较明确：初步诊断为1.紫癜待诊;2.重度血管炎;3.双下肢皮肤溃疡伴感染;4.高血压3级 很高危;5.双膝骨关节炎。初步的诊疗计划为1.向上级医师汇报患者病情;2.向患者及家属交代病情;3.完善血常规、CRP、ESR等检查。依据前面的检查结果大部分均为阴性，尚未查明紫癜的原因。当临床诊断陷入迷茫的时候，检验科及时沟通，送来反馈意见。经与检验医生讨论后加送“冷球蛋白检测”，结果阳性。新增“冷球蛋白血症”的诊断。查明皮肤紫癜与出凝血功能关系不密切，由冷球蛋白血症引起。但引起冷球蛋白血症原因尚未查明，考虑存在血液系统疾病的可能，转入血液科进一步诊断治疗。结合前面的检查结果和诊断意见，同时考虑患者基础状况尚可，加做骨髓穿刺和骨髓活检，行流式免疫分型检查。骨髓形态学考虑多发性骨髓瘤。骨髓活检：送检之骨髓造血组织增生尚可：造血组织与脂肪组织之比约1：1.5;粒红比约4：1，以粒细胞为主(MPO+);巨核细胞2-4个/HPF;三系细胞形态未见明显异常。另见少数淋巴细胞及浆细胞散在及小灶性分布。特殊染色(FOOT染色)：网状纤维不增加(MF-0)。骨髓流式免疫分型结果提示：FCM查见克隆性浆细胞，其比例为2.9%，限制性表达胞浆Kappa轻链，不表达Lambda轻链。血清蛋白电泳提示(如图8所示)：M蛋白15.9%。免疫固定电泳：免疫球蛋白G 15g/L，免疫球蛋白A 364.00mg/L，免疫球蛋白M 378.00mg/L，KAP轻链14.70g/L，LAM轻链1.84g/L，血KAP/LAM比值7.99，IgG KAP型M蛋白 阳性(+)。其他辅助检查结果支持上述形态学诊断，临床诊断多发性骨髓瘤。知识拓展冷球蛋白血症因血清中存在冷球蛋白( cryo- globulins，CGs)而成为一种症候群，其病理机制为免疫复合物在血管壁沉积并激活补体所致的小血管炎。CGs是一种球蛋白，体外观察当血清置于<37℃保温时，CGs发生沉淀，升温至37℃时复溶解。1947年冷球蛋白特征被首次描述[3]，1966年有紫癜、关节痛、乏力等相似表现的29例患者被报道称之为冷球蛋白血症相关疾病[4]。根据免疫球蛋白(Ig)的组成，CGs可分为3型：Ⅰ型常与已知的淋巴增殖性疾病有关，如多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞性白血病等;Ⅱ型为单克隆IgM和多克隆IgG的混合型，其中IgM是具有抗自身IgG活性的单克隆类风湿因子(mRF)，多数患者的mRF具有高度限制性，具有称为“WA”的互补决定区(CDR);Ⅲ型则为单克隆成分IgM和单克隆的IgG。后两者称为混合型冷球蛋白血症( MC)。目前认为HCV感染是MC的首要病因，其次为自身免疫病和B细胞淋巴瘤[5]。由于冷球蛋白检测并非常规检测项目，往往根据标本性状和部分项目的检测结果给予提示后检测。并且相关临床表现常常和淋巴瘤本身的症状重叠，所以淋巴瘤合并冷球蛋白血症往往不能及时得到确诊。本次从血常规结果入手，结合肉眼观察和显微镜下形态观察初步判断可能为冷球蛋白血症，然后结合冷球蛋白的检测结果阳性以及血清蛋白电泳、免疫固定电泳结果，最终确诊为多发性骨髓瘤合并I型冷球蛋白血症。高粘血症[6](主要见于I型冷球蛋白)其主要症状：神经(头疼，意识模糊)，眼(视物模糊，失明)，耳鼻(鼻衄，失聪)，急性肾衰竭(小管内大量冷球蛋白凝集);检查：眼底镜发现出血;血液粘稠度增加;血管炎：症状：发热、乏力、肌痛、关节痛(44%～71%);紫癜(运动/脱毛/久站/闷热天气诱发)最为常见(54%～82%)，严重者溃疡、肢体远端坏死;肾病(20%)：蛋白尿、镜下血尿、红细胞管型，少见肾炎、肾病综合征，70%伴有高血压，40%～60%伴有肌酐升高;外周神经病变(20%)：多为多发，可快速进展，疼痛烧灼感，夜间加重，可有运动受累;血管炎其他少见系统受累：胃肠(2%～6%)：发热、血便、穿孔、休克，可累及胆囊;肺(<5%)：呼吸困难、干咳、肺间质纤维化，急性肺出血，少见胸膜受累;中枢(6%)：脑出血，颅内弥散缺血(MRI);心脏(<10例)：心肌梗死，心包炎，充血性心力衰竭。上述列举的大多数临床表现在本次病例中存在，结合血常规结果及标本的外观，综合判断其存在高粘血症。从报道中可见，冷球蛋白血症不一定与淋巴瘤同时诊断，一部分患者先出现冷球蛋白阳性多年后诊断淋巴瘤，但此类患者往往合并HCV慢性感染。紫癜关节痛和肾病、神经症状是淋巴瘤合并冷球蛋白血症最常见的症状，其无特异性容易被临床医生忽略，但临床中往往同时伴有上述两种或以上的症状，其紫癜同血小板减少性紫癜相比，前者更融合突出皮面;病理中小血管炎是重要的诊断依据而非表现为淋巴瘤细胞浸润。治疗主要是针对淋巴瘤的标准治疗，但从报道中可见HCV相关的冷球蛋白阳性淋巴瘤，尤其惰性淋巴瘤仅仅抗病毒很多患者均有明显缓解，侵袭性淋巴瘤则需要联合免疫化疗。但对于合并威胁生命的冷球蛋白血症的临床表现，如快速进展肾炎、中枢受累或肠缺血或肺泡出血，则推荐先进行血浆置换+激素冲击、美罗华，首先病情平稳后再行标准方案化疗。综上所述，掌握冷球蛋白血症患者的临床特点可以使得临床医生在诊治淋巴瘤时提高对此合并症的及时确诊率，利于在治疗中个体化治疗和疗效评价。当然冷球蛋白的实验室检测是诊断及对其分型的基础，依据临床表现或者实验室检测结果提示申请冷球蛋白检测，可以减少临床医生对淋巴瘤合并冷球蛋白血症的漏诊。案例总结本次案例是一次典型的检验与临床结合，辅助临床查明病因并明确诊断的经典案例。本次病例入院诊断明确。前期诊断：1.紫癜待诊;2.重度血管炎;3.双下肢皮肤溃疡伴感染。在入院后完善常规检查的基础上发现血常规结果异常，但由于职业敏感性和认识不足，多次将标本定义为“不合格标本”。标本性状表现为胶冻状，性状检查时与血凝块外观极为相似，这实属罕见。通过形态学镜检发现冷球蛋白结晶后，其冷凝集的血常规结果模式也与常规冷凝集结果模式(MCHC>365g/L)相差甚远，本病例呈现RBC和HGB成比例升高。发现异常后及时与临床沟通，在临床医生共同努力下明确冷球蛋白血症。然后通过进一步检查，查明冷球蛋白血症真正的病因：多发性骨髓瘤。其中的曲折艰辛，是一线临床工作人员在疾病诊治过程中每天都需要面对的，但是良好的沟通，可以缩短检验与临床的距离，让疾病的诊断变得简单，从而避免很多不必要的检查。检验人员在处理大量临床常规标本的重复劳动过程中，避免审美疲劳，保持必要的好奇心和职业敏感性。只有这样才能在平常中发现异常，辅助临床医生对疾病做出快速有效的诊断。专家点评专家点评： 华西医院检验科 郑沁教授本次病例从实验室异常结果的实验室表现入手，及时有效的对异常结果进行复核并调查原因，从而在血涂片镜检的形态筛查中发现冷球蛋白结晶。初步判断为存在冷球蛋白。进而通过实验室检查明确冷球蛋白的存在(冷球蛋白实验
阳性)，确诊冷球蛋白血症。进而通过检验医生与临床医生的共同努力，通过查阅文献，结合免疫球蛋白检查，血清蛋白电泳、免疫固定电泳等检查结果，确定为IgG
Kappa型单克隆免疫球蛋白。进而确诊为I型冷球蛋白血症，并且依据骨髓图片形态学检查结果和上述血清学结果，明确多发性骨髓瘤的诊断
，最终确诊为多发性骨髓瘤合并I型冷球蛋白血症。很好的解释了患者的多种临床表现,，如双下肢中度血管炎,，下肢软组织感染,，血压,，膝骨关节炎等。在治疗后期出现急性肾损伤,，与其高粘血症密切相关。本病例后期经过标准BD化疗方案化疗缓解后出院,，算得到了及时有效的治疗。在本次病例的诊疗过程,，实验室检测结果结合临床诊断思维最终使患者得到准确诊断的良好体现。也是实验室同临床进行有效沟通的典范。参考文献[1]高琛妮，沈平雁，潘晓霞，等。16例冷球蛋白血症患者临床病理特点分析[J].内科理论与实践，2019，14(5)：298-302[2]袁同玲，赵毅，张伶姝，等。32例冷球蛋白血症患者临床、血清学和病理特点[J].科学技术与工程，2020，20(23)：9302-9307[3]Lerner
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