一、背景慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍然严重威胁国人健康。现有的抗HBV药物核苷（酸）类似物[nucleos（t）ide analogues，NAs]和聚乙二醇干扰素（pegylated-interferon α，PEG-IFN-α）尚不能在短期内治愈慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）。存在于肝组织内的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）是HBV复制的源头，与慢性持续性感染和CHB难以治愈密切相关。但cccDNA的检测需要有创的肝穿活检，无法广泛开展。探索能够反映肝组织内cccDNA存在及转录活性的血清替代指标，以客观评价抗病毒疗效及判定合适的停药时机乃当下之亟需。血清HBV RNA是近年发展起来的HBV病毒学指标，我国《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》和欧洲肝病学会（European Association for the Study of the Liver，EASL）的《乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南（2017年版）》均指出，血清HBV RNA水平可反映肝组织cccDNA转录活性，与患者的病毒学应答及预后相关。2019年EASL和美国肝病学会（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）联合发表的HBV治疗终点会议报告中，也提出将血清HBV RNA作为cccDNA存在和转录活性的测定指标。近期，我国批准了第一款血清HBV RNA检测试剂，相信随着更多标准化HBV RNA检测试剂的诞生，将会极大地拓展其在临床中的应用。本共识将从血清HBV RNA的生物学特征、定量检测方法和临床应用3个方面进行阐述，并针对检测和临床应用作出推荐意见，以期更好地将该指标用于临床慢性HBV感染者的管理。二、血清HBV RNA的存在形式1. HBV前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）：1984年，Miller等首次在CHB患者血清中观察到以HBV DNA-RNA杂合分子形式存在的HBV RNA。1996年，德国学者Köck等通过cDNA末端快速扩增的方法证实了慢性HBV感染者的血清中存在多聚腺苷酰（polyA）化的HBV RNA。但直到20年后的2016年，才有学者证实血液中HBV RNA的主要来源为未经逆转录的HBV pgRNA，存在于有病毒外包膜包裹或裸的核衣壳内。考虑到可能的潜在感染性，国内学者将前者称为“HBV RNA病毒样颗粒”。此外，伴随着逆转录过程，P蛋白的RNase H活性会将作为模板的pgRNA自逆转录起始点逐步降解，并由此产生3′末端不同长度缺失的pgRNA。NAs在抑制负链DNA逆转录合成的同时，会显著增加3′端缺失pgRNA的释放。2. HBV pgRNA剪接变异体和3′端截短型pgRNA：CHB患者血清中的HBV RNA主要来源于包裹在核衣壳内的pgRNA，且除了全长pgRNA及其逆转录残余外，还有不同形式的pgRNA剪接变异体和3′端截短体等。自1989年科学家首次在HBV感染者的肝脏中鉴定出pgRNA剪接变异体以来，已陆续报道20种可分泌至细胞外的pgRNA剪接变异体（sp1-sp20）。其中最主要的剪接变异体类型是剪接供体位点和受体位点分别位于2 447 nt和489 nt的sp1，其含量可以达到pgRNA总量的30%。HBV基因组有位于1 919 nt的经典加尾信号（UAUAAA）和位于HBx编码区1 787 nt的非经典加尾信号（CAUAAA），分别产生3.5 kb全长pgRNA和缺失了两个加尾信号之间序列的截短型pgRNA。近期的研究结果表明，随着CHB患者治疗时间的延长和年龄的增长，截短型pgRNA占患者血清总HBV RNA的比例会有所升高。3. HBx转录本：近年来发现，HBx转录本也是血清HBV RNA组分之一，但含量较低。其存在形式主要有3种，分别为5′端始于HBx编码区第一个ATG上游的编码全长HBx蛋白的“典型”转录本、第一个ATG之后的编码截短HBx蛋白的转录本以及包含了P蛋白开放阅读框的超长HBx转录本。三、血清HBV RNA的定量检测1.血清HBV RNA定量检测技术：目前用于定量检测血清HBV RNA的技术主要为基于TaqMan探针法的逆转录-定量聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR）。考虑到HBV RNA水平呈现出从preC/C、S到X区的逐渐降低，建议将血清HBV RNA检测的靶区域设计在pgRNA 5′端，并尽量位于sp1剪接供体位点2 447 nt之前。此外，有研究在逆转录的引物上添加一段人工设计的随机“锚定序列”并作为定量引物，以排除HBV DNA的干扰。实时恒温扩增和检测技术（simultaneous amplification and testing，SAT）技术也已被成功用于血清HBV RNA的检测，该技术或有助于进一步规避核酸提取产物中混杂的DNA对HBV RNA定量的干扰。推荐意见1：血清HBV RNA检测试剂的标靶区域应位于pgRNA的5′端，并位于2 447 nt（sp1剪接供体位点）之前。2.血清HBV RNA定量检测的溯源与标准化：中国食品药品检定研究院已经研制出“乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家标准品”（批号340008-201901），其来源于临床HBV RNA阳性患者的血浆冻干粉，单位为U/ml，适用于HBV RNA定量检测试剂盒的质量评价。同时，也需使用不同试剂盒平行检测来源于不同临床场景（如不同自然分期、治疗史及病毒基因型等）患者的样本，比较HBV RNA定性结果（阴阳性结果）的一致性，比较定量结果的正确度、精密度、抗干扰性、灵敏度、线性范围等关键性能指标，有助于商品化试剂性能的进一步完善。但目前仍缺乏国际公认的标准物质，HBV RNA定量检测的量值溯源和标准化也是目前迫切需要解决的问题之一。3.血清HBV RNA定量结果的解读：表1总结了血清HBV RNA定量检测的不同结果形式，以及对应的解读。表1 HBV RNA定量检测不同结果形式及其对应的解读注：CV：变异系数四、血清HBV RNA的临床意义1.血清HBV RNA与肝组织内cccDNA的相关性：血清HBV RNA主要由肝细胞核内的cccDNA模板转录而来，故可用于反映cccDNA的拷贝数量及其转录活性。研究发现，在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染患者中，其血清HBV RNA定量和肝内cccDNA定量存在一定相关性（r=0.250～0.781），不同研究之间相关系数的差异可能与队列患者临床特征以及血清HBV RNA和肝内cccDNA检测方法的不同有关。但对NAs经治的CHB患者，既往研究则显示血清HBV RNA定量和肝内cccDNA定量之间无明显相关性。然而，恩替卡韦（entecavir，ETV）治疗后患者血清HBV RNA水平与肝内cccDNA的转录活性（即肝内HBV RNA定量与cccDNA定量的比值）呈正相关（r=0.584，P=0.001），提示NAs治疗后血清HBV RNA定量可能反映的是肝内cccDNA的转录活性而非定量水平。此外，有研究巧妙地以拉米夫定耐药（lamivudine resistance，LAMR）突变位点（rtM204Ⅰ/Ⅴ）作为区分原有的和新合成cccDNA以及血清HBV RNA的特征性标志物，发现LAMR患者的血清HBV RNA与肝内cccDNA的LAMR突变比例高度相关（r=0.96，P=0.000 1），从“质”的角度阐明NAs治疗后血清HBV RNA水平与肝内cccDNA的相关性。对于PEG-IFN-α治疗的患者，尽管近期一项小样本量研究报道，血清HBV RNA定量在治疗前后均与肝内cccDNA定量呈中度相关（r=0.781、0.728，P<0.001）。但由于IFN对cccDNA和HBV RNA存在直接或间接的降解作用，PEG-IFN-α治疗下血清HBV RNA可否准确反映cccDNA的水平及其转录活性仍需进一步明确。综上所述，对于未经抗病毒治疗或经NAs治疗的慢性HBV感染患者，血清HBV RNA有望作为反映肝内cccDNA定量或转录活性的标志物。推荐意见2：血清HBV RNA是反映肝内cccDNA数量和遗传组成及其转录活性的无创性标志物，但应注意抗病毒治疗对血清HBV RNA与肝内cccDNA定量水平相关性的影响。2.血清HBV RNA与其他病毒学指标的相关性：在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者中，血清HBV RNA水平与血清HBV DNA、HBsAg和HBV核心相关抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）定量均呈正相关，且在HBeAg阳性CHB患者中更为明显；而在启用NAs抗病毒治疗后，患者血清HBV RNA与HBV DNA和HBsAg之间的相关性会逐渐下降甚至消失，但与HBcrAg始终保持着较好的相关性；此外，对于接受PEG-IFN-α治疗的患者，血清HBV RNA与HBV DNA和HBcrAg在治疗前后均具有良好相关性，但治疗后与HBsAg的相关性明显减弱，甚至失去相关性。推荐意见3：血清HBV RNA水平与其他血清病毒学定量检测指标的相关性应考虑抗病毒治疗状态的影响。经NAs抗病毒治疗后，血清HBV RNA与血清HBV DNA和HBsAg的相关性均下降甚至消失；但其与HBcrAg在治疗前后皆存在较好的相关性。3.血清HBV RNA在区分HBV感染自然史中的价值：慢性HBV感染自然史可分为免疫耐受、免疫清除、免疫控制和再活动4期。但因缺少患者的肝脏组织学结果，临床上依据无创性指标对患者的分期会有部分患者被归为“灰色阶段”，仍需无创性指标进行完善。早期曾有研究结果显示血清HBV RNA水平在自然病程分期中的分布规律与血清HBV DNA水平类似，且可用于预测CHB患者的自然史分期。近期中国香港和北美学者的横断面研究结果均显示，与以往传统的病毒标志物相比，血清HBV RNA在区分慢性HBV感染者的自然病程方面未凸显出应用优势。未来仍需在大样本量且有肝组织学结果的慢性HBV感染人群中进一步探究。4.血清HBV RNA预测患者治疗应答的价值（1）血清HBV RNA预测NAs治疗应答：越来越多的证据表明，血清HBV RNA可用于预测CHB患者接受NAs治疗的应答情况，包括病毒学应答和HBeAg血清学应答。最早来自德国的一项小样本临床研究结果显示，HBV RNA在治疗前以及治疗3个月或6个月后的下降水平，相较于血清HBV DNA或HBsAg，可以更好地预测HBeAg血清学转换。但考虑到绝大部分接受一线NAs治疗的CHB患者可实现病毒学应答，且患者发生HBeAg血清学应答与否并不改变治疗方案，因此，目前血清HBV RNA在预测NAs治疗应答方面的应用前景较为有限。（2）血清HBV RNA预测PEG-IFN-α治疗应答：不同于NAs抑制pgRNA逆转录的抗病毒机制，PEG-IFN-α抗病毒治疗机制包括调控宿主免疫、降解或沉默cccDNA以及影响pgRNA的包装和稳定性等，治疗下血清HBV RNA的下降也就更为明显。目前的研究结果显示，血清HBV RNA可有效预测PEG-IFN-α治疗应答，但与血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg等传统病毒标志物相比，其预测效能并无显著优势。一项纳入了133例HBeAg阴性CHB患者的随机对照研究结果表明，PEG-IFN-α治疗12周与24周时的血清HBV RNA对于预测治疗应答（定义为72周HBV DNA<2 000 IU/mL且ALT复常）的受试者操作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curves，AUROC）分别为0.630和0.668，进一步与传统的HBV标志物联合也未能有效提高早期预测干扰素治疗应答的效能。在HBeAg阳性的患者中，PEG-IFN-α治疗基线、治疗12周和24周时的血清HBV RNA水平虽也有预测HBeAg血清学转换的价值（12周预测效果最佳，AUROC>0.75），但与传统的HBV标志物相比，未见突出优势。在预测HBsAg清除方面，一项针对HBeAg阴性CHB患者的研究发现，PEG-IFN-α治疗12周时血清HBV RNA水平更低的患者更容易实现HBsAg转阴或HBsAg下降。类似地，另一项基于2个随机对照试验的研究（HBeAg阳性176例，HBeAg阴性103例）表明，在PEG-IFN-α治疗24周实现HBV RNA应答（定义为HBV RNA下降>2 log10 IU/ml或下降>1 log10 IU/ml且低于检测下限）的患者，其后期HBsAg转阴率显著高于未实现HBV RNA应答的患者（10.4%与0.8%），且在伴有HBsAg下降>1 log10 IU/ml的HBV RNA应答者中，HBsAg的阴转率更高（28.6%）。但一项纳入了727例HBeAg阳性患者的大样本研究显示，治疗12周HBV RNA和HBsAg水平在预测HBsAg转阴的AUROC分别为0.64和0.79，不如HBsAg预测其自身转阴的效能。Lim等也报道了类似的研究结果。推荐意见4：血清HBV RNA可用于预测CHB患者接受NAs和PEG-IFN-α治疗的应答情况。5.血清HBV RNA指导患者NAs停药的价值：尽管各大指南推荐对治疗前HBeAg阳性的患者在巩固治疗至少1～3年方可考虑停药，但按照该停药标准停用NAs 1年内，患者的病毒学复发率和临床复发率仍分别高达30%～100%和6%～76%。因此，亟需新的无创性标志物用于指导CHB患者停药。作为反映肝内cccDNA转录活性的无创替代指标，血清HBV RNA近年来受到广泛的关注。早在2013年，一项小样本（36例）研究通过回归分析发现，NAs治疗后3个月时的血清HBV RNA及HBV DNA载量与停药后病毒反弹显著相关（Ｐ=0.043）。有学者观察到，HBeAg阴性感染者经NAs治疗后，即使HBV DNA被显著抑制，血清HBV RNA仍可持续被检测到。此后，一项前瞻性停药研究（130例）的结果显示，血清HBV RNA可有效预测NAs停药后复发，停药时血清HBV RNA阴性的患者停药后4年累积病毒学复发率和临床复发率均显著低于HBV RNA阳性患者。与血清HBV RNA或HBV DNA单阳性的患者相比，HBV RNA/DNA双阴性的患者，其停药后4年的临床复发率更低（8.0%与31.4%）。此外，研究进一步发现，在停药时血清HBV RNA阴性且HBcrAg<4 log10 U/ml的患者，其停药后4年期间临床复发率为0。另一项前瞻性研究（114例）也肯定了血清HBV RNA对预测NAs停药后病毒学复发的价值。该研究发现，停药时血清HBV RNA高于检测下限（44.6 U/ml）、低于检测下限和检测不到的患者，NAs停药后48周累积病毒学复发率分别为93.2%、52.1%和36.6%（Ｐ<0.001）。需要注意的是，该研究也显示停药时HBV RNA检测不到且HBsAg<10 IU/ml的患者，在停药后48周累积病毒学复发率为9.1%。此外，血清HBV RNA也被认为可用于预测停药后HBsAg转阴情况。一项前瞻性队列研究发现，停药时血清HBV RNA阴性合并HBcrAg<4 log10 U/ml的患者在停药l4年后的HBsAg清除率显著高于其他患者（16.1%与1.3%，Ｐ=0.002）。另一项随访时间更长的研究也展现出了类似的结果，停药时血清HBV RNA<1 000拷贝/ml的患者停药后累计6年HBsAg清除率显著高于HBV RNA≥1 000拷贝/ml者（30.9%与1.6%，P=0.007）。综上所述，NAs停药时已实现血清HBV RNA转阴的患者停药后复发风险更低，但不能完全排除复发的可能性。目前比较明确的是，对于符合现行停药标准的接受巩固治疗的患者，若血清HBV RNA检测阳性，应持续进行抗病毒治疗以避免停药带来的疾病复发风险。推荐意见5：对于符合现行停药标准的接受巩固治疗的CHB患者，若血清HBV RNA检测阳性，应持续进行抗病毒治疗以避免停药带来的疾病复发风险。6.血清HBV RNA预测肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的价值：首个来自前瞻性抗病毒治疗CHB队列（2 974例）的研究发现，血清HBV RNA水平是NAs治疗过程中HCC发生的独立危险因素（校正HR=2.21，P=0.005），提示在NAs治疗过程中，血清HBV RNA转阴有利于CHB患者的长期预后。近期的一项病例对照研究结果也显示，NAs治疗过程中发生HCC患者的血清HBV RNA水平显著高于非HCC患者（P=0.004）。未来应进一步探索不同疾病分期和不同疗程下血清HBV RNA水平及其动态变化在HCC发生、发展中的作用。7.血清HBV RNA与慢性HBV感染患者肝脏组织学的相关性：一项小样本（47例）研究发现，血清HBV RNA水平与CHB患者肝脏炎症活动度和纤维化分期均相关（r=0.665、0.722，P值均<0.001），以2.45 log10拷贝/ml作为截断值，血清HBV RNA均可以很好地区分炎症活动度和纤维化评分<2和≥2的标本（AUROC=0.88、0.85），且均优于血清HBsAg的诊断效能。研究进一步通过原位杂交技术观察到肝组织内HBV RNA阳性细胞多呈现“簇状”聚集分布且与HBsAg在空间位置上较一致，提示血清HBV RNA水平可反映肝内病毒的转录活性，且与肝组织活动度和其他病毒复制指标相关。综上所述，血清HBV RNA的定量检测及其临床应用近年来已成为本领域的热点，国际相关指南或共识也逐渐引用血清HBV RNA指标（表2）。表2 血清HBV RNA检测指标写入国内外肝病相关指南、共识或指导性文件情况汇总注：HBV：乙型肝炎病毒；HCV：丙型肝炎病毒；cccDNA：共价闭合环状DNA；NAs：核苷（酸）类似物；EASL:欧洲肝病学会；AASLD:美国肝病学会；HBsAg：乙型肝炎病毒表面抗原；HBeAg：乙型肝炎病毒e抗原；HCC：肝细胞癌五、问题与展望在检测方面，未来应在血清HBV RNA分子生物学表征的基础上开发更加准确可靠的血清HBV RNA检测方法。更重要的是，目前国际并无针对HBV RNA定量检测的标准品和标准化方法，血清HBV RNA量值溯源和标准化也是亟待解决的问题之一。在临床应用方面，由于依赖肝活检，肝内cccDNA拷贝量和转录活性往往无法准确检测。前期相关研究结果表明血清HBV RNA在一定程度上能够反映CHB患者肝内cccDNA转录活性，但区分慢性HBV感染自然病程的作用仍有待进一步在大样本、不同人群的队列中研究。在预测抗病毒应答方面，由于NAs治疗中HBeAg血清学转换的临床重要性受到挑战，因此，血清HBV RNA在预测NAs治疗中HBeAg血清学应答的应用场景有限。尽管如此，血清HBV RNA在预测NAs停药后复发方面有着不错的表现，停药时实现血清HBV RNA转阴的患者停药后复发风险更低，可在临床上协助筛选真正可停药的患者，但该指标对停药后持续应答的预测价值仍有待研究。前期研究还提示血清HBV RNA可用于预测CHB患者的HCC发生风险，提示血清HBV RNA转阴有利于CHB患者的长期预后，未来也期待有大样本、长期随访的CHB抗病毒队列研究进一步阐明。随着抗HBV新药尤其是靶向衣壳组装兼具cccDNA合成抑制功能的核心蛋白变构调节剂类药物的研发和未来可能的成功上市，血清HBV RNA的临床意义将不断被挖掘和明确。最后，在卫生经济学方面，未来应明确应用该指标的临床场景，在充分发挥其诊断和疗效评估价值的同时，最大限度降低患者和社会的经济负担。咨询指导专家（按姓氏首字母拼音顺序）：蔡大川、陈成伟、陈娟、陈军、陈瑜、成军、戴二黑、党双锁、邓强、窦晓光、封波、冯亦农、高志良、Ju-Tao Guo、侯金林、胡波、胡国信、黄爱龙、贾继东、江建宁、李伯安、林炳亮、刘妍、娄金丽、鲁晓擘、宓余强、毛青、牛俊奇、欧启水、彭劼、彭亮、任红、任万华、沈弢、苏瑞、唐红、王福生、王磊、王雅杰、韦嘉、谢青、徐东平、徐小元、袁正宏、叶永安、尤红、于乐成、张大志、张继明、张缭云、张欣欣、赵鸿、赵景民；中华医学会肝病学分会基础医学与实验诊断协作组成员本文来源：中华肝脏病杂志, 2022,30(5) : 505-512. （责任编辑：dawenwu）
