新型冠状病毒刺突蛋白结构及其疫苗研发

佰傲谷A-A+新型冠状病毒肺炎大流行在全球范围内造成严重的公共卫生危机。中文摘要  新型冠状病毒肺炎大流行在全球范围内造成严重的公共卫生危机。为预防新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）对健康带来的不利影响，不同类型、不同生产工艺的SARS-CoV-2疫苗相继被研发，包括减毒活疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗、灭活疫苗和重组蛋白疫苗等，而病毒表面的刺突蛋白是SARS-CoV-2疫苗的研究热点。此文主要介绍SARS-CoV-2刺突蛋白的结构、功能与免疫学特性，以及相关SARS-CoV-2疫苗的研究情况、安全性、适用性等，并讨论潜在问题解决措施。正文  新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在我国传染病防治法中被纳入乙类传染病，采取甲类传染病的防控措施。截至2022年3月15日，根据WHO发布的相关疫情统计数据，全球累计确诊已超过4.5亿例，累计死亡超过600万例。面对如此严峻的形势，各国研究人员加快了研制SARS-CoV-2疫苗的步伐。本文就SARS-CoV-2刺突（spike，S）蛋白的结构、功能以及基于S蛋白的SARS-CoV-2疫苗的安全性和适用性等潜在问题展开综述。  /01/S蛋白结构、功能及其受体  1.1 S蛋白的结构与功能SARS-CoV-2的S蛋白为病毒表面的一类标志性跨膜蛋白，是由3个相同的亚基通过非共价键的方式结合形成的同源三聚体[1]，其相对分子质量为141 178，含有1 273个氨基酸[2]。完整的S蛋白由胞外元件、跨膜部分和胞内C片段构成，胞外元件由氨基端的S1和羧基端的S2两个亚单位构成。其中，球形的S1负责介导病毒与胞膜受体结合，柄状的S2负责介导随后的膜融合过程。S蛋白冠部由3个S1亚单位构成，茎部由1个S2亚单位构成[3]。SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列与SARS冠状病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV)的序列有约75%的同源性[4]。SARS-CoV-2和SARS-CoV的S1亚单位序列相似性接近70%，而S2亚单位有接近99%的相似性[5]。1.2 S蛋白的受体SARS-CoV-2的细胞受体血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽。目前认为，在SARS-CoV-2感染中，ACE2为病毒进入细胞的主要受体。除ACE2外，Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶（type Ⅱ transmembrane serine protease，TMPRSS2）也在SARS-CoV-2感染细胞时发挥重要作用，二者同时在Ⅱ型肺泡细胞中共同表达。ACE2作为含锌羧肽酶的Ⅰ型跨膜蛋白，多表达于肾脏、心脏和男性生殖系统，同时也在肺、小肠和肝脏等组织中表达[6]，见图1。        部分COVID-19患者临床初期的表现例如呕吐、腹泻等症状，可能与ACE2在肠道的分布有关[7]。ACE2已被证明是SARS-CoV的S蛋白感染肺泡细胞时的主要受体[6]。ACE2有两类功能：一是作为催化活性的蛋白酶降解血管紧张素Ⅱ；二是作为受体介导SARS-CoV-2的入胞，即ACE2的非蛋白依赖。因此，病毒可通过ACE2的非蛋白依赖功能感染人体，引起ACE2蛋白含量的减少和功能的衰退[8]，使肺的相关组织出现不同程度的损伤。SARS-CoV-2感染的人ACE2转基因小鼠具有间质性肺炎的典型病理学表现，而感染SARS-CoV-2的野生型小鼠则无上述症状[9]。另外，SARS-CoV-2易感染表达ACE2的细胞，但不易感染未表达ACE2的细胞。且Hoffmann等[10]研究表明，ACE2在SARS-CoV-2入胞过程中发挥的作用无法被氨基肽酶N等跨膜糖蛋白代替。因此，SARS-CoV-2可利用ACE2作为进入细胞的受体。TMPRSS2则用于S蛋白的活化过程。在酸性条件下，SARS-CoV-2与Ⅱ型肺泡细胞的TMPRSS2结合后可激活S蛋白，使其切割质膜进入细胞，TMPRSS2在促进膜融合以及病毒的入胞过程中发挥重要作用[11]。SARS-CoV-2通过S蛋白结合、感染细胞后，可使前者黏附并感染健康的细胞，加速病毒传播[12]。表达TMPRSS2和ACE2的细胞被SARS-CoV-2感染的风险，比不表达TMPRSS2和ACE2或只表达其一的细胞大幅提高[13-14]。/02/S蛋白与受体的相互作用  2.1 受体结合域（receptor binding domain，RBD)作用下的结合过程在S1亚单位识别并结合受体的过程中起到关键作用的是S1上的RBD，其位于S蛋白的331—524氨基酸位置[2,15]。S蛋白在不同的结合状态下可呈现不同的结构和形状，RBD在不同结合状态时同样呈现不同的构象[16]。处于非结合状态时，SARS-CoV-2的S蛋白会保持亚稳定的三聚体构象，此时的RBD为“down”结构，被隐藏。而在S1亚单位与宿主细胞表面的ACE2受体相结合时，细胞的蛋白酶会切割S蛋白的S1/S2切割位点，S蛋白三聚体的稳定性会被破坏，导致S1亚单位脱落、S2亚单位空间构象发生转变，形成稳定的结构[17]。同时，RBD会转化为“up”结构，暴露出来，使S蛋白与细胞的ACE2结合。可见，S蛋白在SARS-CoV-2与膜结合的过程中具有不可或缺的功能。研究显示，SARS-CoV-2对于ACE2的亲和力比SARS-CoV强约10倍[17]。而根据Wan等[18]的研究，SARS-CoV-2 S蛋白487残基位处的突变S487T，可能使SARS-CoV-2的受体-S蛋白相互作用更强，致使感染性也更强。S蛋白主要由信号肽、N端结构域、RBD、融合肽段、七肽重复序列(heptad repeat，HR)1、HR2、跨膜结构域、胞质结构域等构成，同时具有S1/S2与S2´两个切割位点[5]。S蛋白的氨基酸顺序如图2所示[17]。相关研究显示，HR1和HR2会在S1的RBD与靶细胞的ACE2结合后，形成融合核心（6-HB），提高病毒融合和感染的效率[19-20]。2.2 SARS-CoV-2主要突变位点分析自SARS-CoV-2被发现以来，全世界范围内已有20多个变异株，截至2022年1月7日，WHO定义了5个关切变异株（variant of concern，VOC），即阿尔法(α)、贝塔(β)、伽马(γ)、德尔塔(δ)和奥密克戎(ο)。如图3所示，α变异株RBD中存在1个突变N501Y，增强了S蛋白与受体ACE2的亲和力，在提高感染力的同时增强自身的免疫逃逸。β变异株存在3个位于RBD的突变K417N、E484K、N501Y，提示该变异株具有较高的传播力和感染力，并在一定程度上降低疫苗的中和活性。γ变异株存在3个位于RBD的突变K417T、E484K、N501Y，与β变异株相似，可能降低疫苗的中和活性。δ变异株S蛋白存在8个突变，2个（L452R和T478K）在RBD。ο变异株在RBD上存在15个突变，包括E484A、K417N等与免疫逃逸相关的突变，提示其可能具有很强的耐药性和免疫逃逸能力。表1列表统计整理了上述5个VOC，并简要分析其突变结果。VOC在RBD的突变呈现递增趋势，致使疫苗的中和活性下降。全球首个ο血清中和试验显示，疫苗接种者血清对ο变异株的中和活性仅为原始毒株的1/22[21]。SARS-CoV-2 S蛋白的484和417位氨基酸的突变与免疫逃逸有关，β变异株的E484K、K417N突变，γ变异株的K417T突变都在不同程度上降低了临床使用的单克隆抗体（单抗）的中和作用，存在相似变异的ο变异株可能对针对该类位点的单抗产生抗药性。而K417N、Q493R、N501Y、N505H的突变，可能会增强病毒与ACE2的结合能力并增加其感染性[22]。其中，K417N突变可通过促进RBD与ACE2结合的方式促进入胞。而非RBD的突变，如S1/S2 Furin蛋白酶裂解位点附近的3个突变H655Y、N679K、P681H，前两者可提高ο变异株的免疫逃逸能力，在提高对单抗的抗性方面起重要作用；P681H突变使得Furin蛋白酶与S蛋白的结合亲和力增强，此突变也见于α变异株，可能有利于病毒进入宿主细胞。上述突变导致ο变异株的再感染风险、免疫逃逸风险提高，且提高了重复感染的可能性。/03/SARS-CoV-2 S蛋白疫苗的研发及应用  3.1 S蛋白相关疫苗研发现状目前处于临床试验阶段的SARS-CoV-2疫苗为112种，处于临床前试验阶段的有183种。基于WHO的疫苗研发数据[23]，根据临床试验阶段疫苗相关信息并参考部分文献[24]，表2列出了全球进入临床试验的基于S蛋白的COVID-19疫苗。3.2 S蛋白相关疫苗使用现状截至2022年1月7日，有32种SARS-CoV-2疫苗已上市或获批紧急使用[25]，其中使用时间较长的6种疫苗（保护率）分别为：美国辉瑞/德国BioNTech公司（95%[26]）、美国Moderna公司（94.1%[27]）的mRNA疫苗，英国牛津大学/阿斯利康公司（70.4%[28]）、美国强生公司（美国72%、拉丁美洲66%、南非57%[29]）的腺病毒载体疫苗，北京生物制品研究所有限责任公司、北京科兴生物制品有限公司的灭活疫苗（巴西50.65%、土耳其91.25%[30]）。除上述较常规的疫苗，众多如气溶胶腺病毒疫苗、鼻喷疫苗、口服疫苗等新型疫苗正在研发中。3.3 不同类型的含S蛋白疫苗相关问题3.3.1  灭活疫苗  灭活疫苗在疫情初期发挥了较大的作用，对SARS-CoV-2变异株B.1.429和α变异株仍保持免疫效力，但对其他VOC的效果并不理想，例如β、γ变异株的血清中和效率显著降低[31]。灭活疫苗相对稳定，安全性较高，生产工艺简单，但接种1针诱导的免疫应答水平较低、时间较短，须多次接种以加强免疫效果，而且一般需要佐剂。同时，灭活疫苗的安全性应严格把关，须重点关注疫苗制备前的灭活效果。3.3.2  减毒疫苗  美国Meissa Vaccines的MV-014-212和印度血清研究所/美国Codagenix公司的COVI-VAC均为鼻内接种的减毒疫苗，Ⅰ期临床试验效果良好，未出现不良反应，也没有检测到野生型病毒。前者对β变异株有效[32]；后者可对α和β变异株产生稳定的血清中和抗体[33]。减毒疫苗能诱导机体产生与自然感染相似的免疫保护作用，与灭活疫苗相比，免疫原性强、作用时间持久，但保藏温度要求较为严格，而且病毒可能出现毒性回复等问题。由于减毒疫苗保留一定毒性，对免疫力低下人群不适用。3.3.3  重组蛋白疫苗  重组S蛋白SARS-CoV-2疫苗的研发主要针对S1亚基设计。其中，美国Novavax公司的亚单位疫苗NVX-CoV2373在英国的Ⅲ期临床试验有效率达89.3%，在南非的Ⅱb期临床试验显示其对变异株501Y.V2的有效率达92.6%[34]；安徽智飞龙科马生物制药与中国科学院微生物研究所联合研制的重组RBD蛋白亚单位疫苗ZF2001[35]已在乌兹别克斯坦上市，成为首个获批临床使用的SARS-CoV-2重组亚单位疫苗。重组蛋白疫苗利用基因工程技术在体外表达修饰基因，比其他疫苗纯化程度更高，但免疫原性较低，抗原表位难以长久维持。可应用佐剂、颗粒免疫原、纳米针、表位重组等技术提高疫苗的免疫原性[34]。糖基化S蛋白的纯化及融合前构型的稳定，佐剂、病毒蛋白载体的合理选择等均是需要关注的问题[36]。抗原的选择也是需要关注的问题，适宜的抗原可以避免不必要的安全问题。另外，还应考虑到抗体持久性，探索持久性不高带来的接种次数过多的问题。3.3.4  病毒载体疫苗  厦门大学和北京万泰生物药业股份有限公司联合研制的复制型病毒载体疫苗DelNS1-2019-nCoV-RBD-OPT1，以NS1基因缺失的流感病毒为载体，表达S基因的RBD序列，并通过鼻内喷雾的形式给药，剂量为注射式疫苗的1/5，已进入Ⅲ期临床试验[37]。非复制型病毒载体疫苗目前有强生公司疫苗（人腺病毒26）、军事医学研究院/康希诺生物股份公司的Ad5-nCoV疫苗（人腺病毒5）、牛津大学/阿斯利康公司疫苗（黑猩猩腺病毒）等。Ad5-nCoV疫苗插入S基因优化序列，Ⅰ期临床试验受试者接种后全部产生抗体，不同剂量组耐受性均较好，无严重不良反应[38]。另两者针对变异株的保护水平均有下降[39]。病毒载体疫苗通过病毒将目的基因在胞内表达抗原，免疫过程与自然感染接近，可激活机体的体液免疫，同时激活广谱的细胞免疫及黏膜免疫，具有安全性高、免疫原性高、作用时间长等优点。但特定人群可能曾感染用于载体的病毒，导致对其存在普遍免疫，体内还可能存在该载体病毒的中和抗体，导致抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement，ADE)，降低疫苗效果。3.3.5  核酸疫苗  核酸疫苗是一种基于DNA或RNA研发的疫苗，将蛋白的基因直接导入细胞，诱导更快速的免疫应答。3.3.5.1  RNA疫苗  编码分泌S蛋白三聚体RBD的BNT162b1、编码全长S蛋白的BNT162b2均为针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗，引起的免疫应答相似，但BNT162b2不良反应发生率更低，而且老年人接种30 μg BNT162b2后7和14 d的50%、90%中和抗体几何平均滴度均超过了恢复期血清组[40]。目前BNT162b2已在英国紧急授权使用。BNT162b2的以色列大规模接种呈现了较好的保护效果，全体保护率为95.3%，感染保护率97%，无症状感染保护率91.5%[41]。另一疫苗mRNA-1273免疫效力与BNT162b2相似[42]。RNA疫苗生产周期较短、设计制备过程较易、研制成本较低，可以通过更改抗原序列较好地应对病毒变异等问题。由于该类疫苗不与宿主细胞基因组接触，因此避免了基因整合的风险。但该类疫苗的运输储藏条件较为苛刻，且由于缺乏技术积累，体内递送等方面存在一定短板。3.3.5.2  DNA疫苗  美国Inovio制药公司与北京艾棣维欣生物技术股份公司联合研制的DNA疫苗INO-4800为全长S蛋白疫苗，Ⅰ期临床试验未出现严重不良反应，接种第2剂后安全性和耐受性良好[43]。INO-4800可以针对SARS-CoV-2 VOC产生稳定的细胞免疫力，并保持良好的中和抗体和T细胞活性[44]。DNA疫苗制备不涉及病毒的复制、基因表达，有着较高的安全性。DNA疫苗可在体内长期表达，并通过宿主细胞诱发细胞和体液免疫，引起更强的免疫保护作用。而且DNA比较稳定，可在标准冷藏温度（2~8 ℃）保藏较长时间，在储存和运输方面有优势。但质粒DNA可能会诱导自身免疫应答，降低疫苗作用。长期表达外源抗原还可能引起机体的免疫耐受，或因表达水平较低被中和抗体清除，失去预防效果。同时，外源DNA有整合入宿主细胞基因组的风险。3.3.6 纳米颗粒疫苗  纳米颗粒疫苗可以提供高密度抗原表位[34]，而且与蛋白亚单位有着相似的结构，能有效激活免疫系统产生良好的免疫应答。目前有5种该类型的COVID-19疫苗进入Ⅲ期临床试验。同时，对刺突蛋白-铁蛋白纳米颗粒（spike ferritin nanoparticle，SpFN）疫苗的研究显示，该疫苗可诱导有效的免疫应答，而且可能对SARS-CoV-2变异株以及其他冠状病毒提供广泛的保护，SpFN疫苗单次免疫K18-hACE2小鼠产生的抗体被动免疫小鼠，可抵抗致死剂量病毒攻击，并且低剂量抗体不会增加ADE风险[45]。纳米颗粒疫苗因不含核酸，不能自主复制，故不具有传染性，而且可通过抗原呈递平台改善抗原呈递的时间，以实现长期免疫，是一类极具利用价值的疫苗。但该类疫苗的作用机理较为复杂，也可能引起免疫病理反应，疫苗的安全性还有待探究。3.4 疫苗面临的挑战3.4.1 SARS-CoV-2的基因变异  在全球COVID-19大流行的背景下，SARS-CoV-2的突变几率大大增加。尤其是在δ毒株变异影响下，疫苗的免疫效力开始降低[31]。尽管如此，疫苗的保护效力依然存在[46]。2021年11月于南非出现的ο变异株在RBD上有15处突变，并在P681H和N679K产生有别于其他变异株的突变，可能使其逃逸免疫系统的能力增强。而且该变异株多达30处的变异位点，可能使之在一定程度上逃避T细胞免疫[47]。因此应持续关注SARS-CoV-2的抗原表位的变化，重点关注S基因的各位点。而S2亚单位的可变性要小于N端结构域，通过设计针对S2亚单位的单抗可减弱S基因突变带来的影响。还应关注SARS-CoV-2其他基因的位点改变，关注抗原漂移情况，以应对可能出现的病毒变异风险，及时做出反应。3.4.2 ADE风险  在关于SARS-CoV-2的临床研究中，有研究者发现SARS-CoV-2有ADE的风险[48-49],即抗体可在一定程度上协助病毒进入靶细胞，提高感染率。SARS-CoV在研究中已被证实有ADE效应[2],其与SARS-CoV-2不仅在基因序列上重合度高，而且在疫苗设计的重点位置S1和S2上也存在很高的同源性[4-5]。尽管刘斌等[50]的研究表明SARS-CoV-2感染引起ADE的风险很小，但是在δ变异毒株中ADE效应却有所展现。因此，在关于SARS-CoV-2的细胞黏附、体内传播等方面应继续研究，并在临床试验中评估潜在的风险，以最大化地降低可能存在的ADE风险。也可选择研发多种类型的疫苗，如核酸疫苗、病毒载体疫苗等，以应对可能出现的ADE风险。3.4.3  疫苗保护持久性  COVID-19疫情暴发速度快、时间短，人们对相关疫苗的免疫持久性研究有限。根据已有临床观察，被病毒感染1~2周后，体内开始出现病毒抗体，之后抗体水平随时间进行性升高，直到抵达峰值，在峰值滴度维持数周后，开始下降。研究发现，康复者体内的中和抗体应答持续时间至少为7个月[51]。按照当前的全球疫情态势，疫苗的持续时间应保持1年左右，以应对疫情中的突发性应急事件。由于尚不清楚SARS-CoV-2 S基因的DNA序列在细胞中的状态，以及是否会影响疫苗的持久性和整合率，研发者在疫苗研制过程中，应选取合适类型的疫苗、选择适宜表达抗原基因的载体等，通过各种方式得到效果良好、持久性高的COVID-19疫苗。3.4.4  疫苗接种产生的不良反应  在相关研究中，疫苗的不良反应发生率从高到低为：病毒载体疫苗、mRNA疫苗、重组蛋白疫苗、灭活疫苗[52]。除疫苗自身之外，还应考虑佐剂的风险，姜辉等[53]的研究显示，佐剂可能会引起机体的过敏反应或者免疫逃逸现象。因此，在疫苗研发过程中，应对疫苗、佐剂以及适应人群进行严格的筛选。如任淑萍等[54]研究证明，采用卡介苗作为佐剂可有效增强树突状细胞的作用，也可诱生多种免疫活性物质，起到良好的免疫保护效果。并且根据Sharma等[55]、Escobar等[56]的流行病学模型可知，卡介苗的接种对于预防SARS-CoV-2有一定作用。而Joyce等[45]发现，SpFN与佐剂ALFQ引起的免疫应答始终优于氢氧化铝佐剂。脂质体类佐剂比ALFQ更易获取、安全性更高，可能成为未来大规模使用的一类佐剂。3.4.5  针对特殊人群的使用  除高风险地区人员、医护工作者、人口流动较大场所的工作人员外，孕妇、老年人、儿童、免疫抑制或缺陷人群也属于高风险人群。例如，孕妇感染SARS-CoV-2可导致妊娠期高血压、早产、产后出血等风险，甚至出现更严重的症状，而大部分的临床试验中却未涉及妊娠期妇女。目前，WHO允许的疫苗适用年龄为18~60岁，60岁以上老年人不在此范围内，但老年人感染率更高，发展成重症的几率较年轻人也更大[41]。而且在接种疫苗后，老年人产生的中和抗体滴度也比年轻人低[57]。针对上述两种情况，疫苗研发时一方面应多方位考虑疫苗的适用人群，或加大非高危人群的接种率，间接保护高危人群；另一方面应在临床研究中开展多层次试验，以获得不同年龄、不同性别个体的数据，指导疫苗设计和接种。/04/展望  目前，COVID-19疫情仍是全球重大的公共卫生问题和挑战，而S蛋白在COVID-19的致病机制及疫苗的研发过程中发挥重要作用。随着对SARS-CoV-2 S基因等的进一步研究，SARS-CoV-2对人体的致病过程将得到更深的理解。面对SARS-CoV-2 S基因的变种，多价疫苗及针对免疫力低下的特殊人群疫苗的研发亟不可待。今后，我们还需进一步加强对SARS-CoV-2及其疫苗的研究，为COVID-19的预防和治疗奠定基础。参考文献（  略  ）作者  范立丁  于美美  崔晏硕  薛庆节济宁医学院第二临床医学院，济宁 272067通信作者：薛庆节，Email：qjxue9797@126.com引用本文：  范立丁，于美美，崔晏硕，等. 新型冠状病毒刺突蛋白结构及其疫苗研发  [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(2): 61-69.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20211109-00072
（责任编辑：dawenwu）