1968年自从发现了HbA1c在糖尿患者群中的升高，很少会已经预示到40余年以后，检测HbA1c会成为糖尿病常规管理和诊断的一个不可缺少的部分。自从里程碑的临床试验（如，DCCT、UKPDS）以来，标准化HbA1c检测已经获得了相当的进展，明确了血糖控制（由HbA1c检测）和并发症的关系。
由于HbA1c检测方法的发展，各个厂商在宣传产品的特点和检测准确度上，很多针对Hb变异体上对检测结果的影响。尤其在我国，厂商竞争做法不太文明的情况下，使我们临床实验室很模糊。其实，任何一个检测方法都有它的特点和优点，当然也一定有它的不足之处。
1、什么是血红蛋白病？
血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。
（1）血红蛋白是一种结合蛋白，分子量64000，由珠蛋白和血红素构成。血红素由原卟啉与亚铁原子组成，每一个珠蛋白分子有二对肽链，一对是α链，由141个氨基酸残基构成，在运氧中具重要生理作用。另一对是非α链，有β、γ、δ、ξ（结构与α链相似）及ε5种；每一条肽链和一个血红素连接，构成一个血红蛋白单体。人类血红蛋白是由二对（4条）血红蛋白单体聚合而成的四聚体。不同类型的血红蛋白珠蛋白结构略有不同，但血红素均相同。
（2）正常人出生后有三种血红蛋白：1）血红蛋白A（HbA），由一对α链和一对β链组成（α2β2），为正常人主要血红蛋白，占血红蛋白总量的95％以上。胚胎二个月时HbA即有少量出现，初生时占10％～40％，出生6个月后即达成人水平；2）血红蛋白A2（HbA2），由一对α链和一对δ链组成（α2δ2）。自出生6～12个月起，占血红蛋白的2～3％；3）胎儿血红蛋白（HbF）由一对α链和一对γ链组成（α2γ2），初生时占体内血红蛋白的70％～90％，以后渐减。至生后6月，含量降至血红蛋白总量的1％左右。
（3）血红蛋白的不同肽链是由不同的遗传基因控制的。珠蛋白基因突变而致肽链的单个或多个氨基酸替代或缺如，导致珠蛋白分子结构改变，称为异常血红蛋白（或血红蛋白变异体）。全世界范围内经结构分析证实的异常血红蛋白日益增多，至90年代初期已达600多种，但仅不到1/3的异常血红蛋白伴有临床症状。世界卫生组织估计，全球约有1.5亿人携带血红蛋白病基因，并已将血红蛋白病列为严重危害人类健康的6种常见病之一。异常血红蛋白病在我国以云南、贵州、广西、新疆等地发病率较高，现已发现异常血红蛋白67种，包括α链（34种）、β链（26种）、γ链（4种）等异常，其中19种为我国首见。海洋性贫血多发于华南及西南地区。根据近10年来我国28个省市、自治区近100万人口的普查资料，异常血红蛋白病的发病率为0.33％，α海洋性贫血的发病率为2.64％，β海洋性贫血的发病率为0.66%。
血红蛋白中大多为血红蛋白A（占约98%），因此检测的糖化血红蛋白自然也以HbA中，其他血红蛋白中没有的β链被糖化的部分来表示糖化血红蛋白（%）。血红蛋白病产生的各种血红蛋白变异体，如果是糖尿病患者，这些血红蛋白变异体也会被糖化，或它们的蛋白结构等也会影响糖化血红蛋白检测结果的可靠性。
2、NGSP标准化和IFCC标准化
正如前述，美国糖尿病协会为了得到糖尿病控制是否可以减少糖尿病并发症的结果，针对当时缺乏HbA1c的参考物质和参考方法情况下，采取了武断的标准化措施，得到了全世界第一个结论，即对糖尿病的控制可以减少或减缓糖尿病并发症的发生。美国为了将研究成果在美国和全世界应用，实施了NGSP计划。由于它的实施，全球今天的HbA1c检测结果以百分值（%）表示的，无不展示了美国NGSP的重大影响。但是，只采用了HPLC的层析技术，以此确定为HbA1c的NGSP结果，被证实分离的HbA1c不是单一蛋白。IFCC的完整的标准化，既有参考物质，又有参考方法。确实在标准化上非常完整。因此，以美国NGSP为主的HPLC层析系统的检测方法，美国糖尿病协会（ADA）承认IFCC为全球的唯一参考系列，并且承认美国的NGSP结果应上溯至IFCC的参考物质和参考方法。这在以往的任何领域从未有过。但NGSP全世界报告HbA1c的影响很大，而且伯乐（Bio-Rad）等专注HPLC离子交换技术的公司，多年来也在HPLC技术上有了很大的改进。
IFCC标准化尽管晚了几年，但是，IFCC对HbA1c的贡献，是前人在这个领域所没有过的。为了使IFCC的成果尽快在临床上的应用，多年来已经形成了免疫技术和酶法技术，用于临床实验室或内分泌实验室对糖尿病患者的HbA1c的检测，可以直接报告IFCC结果。由于IFCC参考方法和参考物质的研究与发展成果检测方法几乎是同一个厂商，所以，在推广免疫方法的产品宣传上，强调免疫方法的结果可直接溯源至IFCC系统，而且可以不受任何血红蛋白变异体的影响；指出HPLC的检测方法无法避免血红蛋白变异体的干扰影响。
在国内市场上，直接报告NGSP和IFCC结果对应的公司竞争非常剧烈。尽管国际上承认二者结果都有效。但是，这已经影响了临床实验室在认识上的模糊。尤其是针对检测方法是否可以特异地消除血红蛋白变异体干扰，是今天竞争的重点。
3、HbA1c各个常规检测方法的分析
（1）以往HbA1c差异的原因之一 在IFCC对HbA1c的被测量定义前，任何血红蛋白被糖化的形式，都是“糖化血红蛋白”的一个组分。确实在定量上非常混乱。仅以正常的血红蛋白为例，由于在血红蛋白上有多个具有游离氨基，它们均可以被葡萄糖糖化形成糖化血红蛋白，而且在糖化中，这些游离氨基被糖化的可能性是随机化的。可以在β-N-Val-1（即血红蛋白β链N-端的第一个氨基酸缬氨酸）、在β链的第17、20、和66个赖氨酸（β-Lys-17、β-Lys-20、β-Lys-66）的ε氨基，和在α链-N端的第一个氨基酸（缬氨酸）（1α-N-Val-1）、在α链的第7、16个赖氨酸的ε氨基，被葡萄糖糖化形成糖化血红蛋白。在上述的7个位点可以被葡萄糖糖化处，被糖化的任意点、各个糖化点的任意组合等，都是使各个方法在检测中具有差异的原因。当出现了血红蛋白的变异体时，还有其他变异体可糖化的位点出现了。
（2）IFCC的HbA1c定义 为了使糖化血红蛋白检测标准化，IFCC定义了：为血红蛋白的β链N端的缬氨酸（Val）被糖化的相应血红蛋白，被称为糖化血红蛋白（HbA1c）。在β链上的其他位点即使被糖化的、以及α链上被糖化的位点，均不予认可为糖化血红蛋白。因此，从定义上第一次明确的标准化，完全是充分考虑到“糖化血红蛋白”在分子结构上的复杂性，只有硬性规定了某个分子结构被命名为“HbA1c”，才能是HbA1c的检测结果在全球具有可比性。
但是，没有被IFCC定义确定的糖化血红蛋白，它们是真实存在的。在检测量值上实现了全球可比性，却为临床遗漏了已经发病的糖尿病患者血液中，其他分子结构的糖化血红蛋白！在糖尿病患者诊疗和监视中，免疫检测HbA1c出现了明显的临床问题。
（3）HbA1c常规免疫检测方法和酶法 由于常规检测方法的限制，IFCC参考方法对未糖化的血红蛋白定义为N-端缬氨酸未被糖化的β链血红蛋白。但是在常规中使用一般方法难以分离出这个未被糖化的β链血红蛋白。还是沿用了传统的临床实验室检测血红蛋白方法，以比色检测样品的“红色”程度表示血红蛋白总量。可惜，这个方法检测出的血红蛋白是样品中含有高价铁离子的所有血红蛋白，包括了正常的α、β、γ、δ、ξ及ε链之外，还有各种异常的血红蛋白病中的各种链。这与IFCC对HbA1c定义中的非糖化部分的血红蛋白，仅仅是β链血红蛋白要求完全不同。所以，使最后报告HbA1c结果的分母部分放大。如果免疫方法使用的抗体完全符合IFCC的HbA1c定义，则最后得到的结果要偏低了。这是在形成HbA1c免疫检测方法开始时，认为检测方法受干扰了。作者介绍使用识别HbA的β-链N-端糖化氨基酸的结构免疫检测量化HbA1c。他说：“使用了第一代检测试剂，内含抗体针对抗原决定簇主要分布在Hb的β-链的第4到第10个氨基酸，包含了在HbS和HbC变异体第6个改变的氨基酸位置。但是在这些Hb变异体存在下，HbA1c检测受到干扰。促使发展了第二代检测，使用的抗体包含了第1到第4个氨基酸。结果第二代检测的抗体极大地消除了来自HbS和HbC的分析干扰，在与第一代检测比较中改善了整个准确度。第二代检测抗体通过结合类似于HbA的HbS和HbC变异体，这样为具有杂合子情况的患者提供了临床上有用的HbA1c值，他们的RBC寿命想来基本上是正常的”。这篇文章的解释让人迷惑。明明使用了与IFCC方法中检测β-链N-端的六肽对应的抗体，检测的是从第4个到第10个氨基酸的多肽链，应该与IFCC参考方法一致，怎么会出现“干扰”了？学习后，我理解了，IFCC参考方法只检测β-链N-端起的六肽，原因是充分考虑到，Hb变异体在蛋白结构上的突变多发生于HbA的β链N-端起，计算的第六个氨基酸位置。
正常的HbA链的N端六个氨基酸序列为Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-；
血红蛋白变异体S（HbS）的N端六个氨基酸序列为：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-；
血红蛋白变异体C（HbC）的N端六个氨基酸序列为：Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys-Glu-。
互相比较，可以发现，HbA、HbS和HbC的第六个氨基酸不同。因此，IFCC专家非常注重此点，只切下六个氨基酸多肽进行分析，消除了HbS和HbC对检测干扰。
现在，经典的免疫方法抗体也遵循了这个特点，避免了HbS和HbC干扰。应该是非常好的。可是，计算糖化血红蛋白的分母部分，因为检测了所有类型的血红蛋白，违反了IFCC对HbA1c的定义，数字放大了。造成最后计算的糖化血红蛋白量的缩小！这个结果被说成是受“干扰”了！
第二代免疫试剂使用的抗体，只针对从N-端的第一个到第四个氨基酸的四肽。这样，被检测的血红蛋白回避了第六个氨基酸是否为谷氨酸的特异性要求。结果任何血红蛋白，只要具有类似HbA的N-端四个氨基酸的各种血红蛋白，全部被检测出来！放大了血红蛋白计算中的分子部分。巧合的是，分母因检测了所有各种非糖化血红蛋白而放大，分子也因检测了各种类似的糖化血红蛋白而放大！二者的放大后数字相除，得到了与IFCC参考方法检测结果非常相似数量！
这样的巧合，可以从某公司资料上非常明确，它们计算的HbA1c结果如下：
式中的分母是总Hb+HbX，这个HbX应该是Hb的变异体。分子是所有被糖化的HbA1c和HbX1c（这是所有Hb变异体被糖化的部分）！问题都明确了。
因此，HbA1c的免疫检测方法在检测量值上可以溯源至IFCC的参考系列，但是，在实际检测中，不受任何血红蛋白变异体影响的说法是不真实的。
HbA1c酶法的第一步，由蛋白酶从血红蛋白β链N-端处切下两个氨基酸的双肽，然后再有几个酶作用水解，最后显色检测。酶法比免疫方法更“简练”，它只用两个氨基酸的小肽。它更加不顾各种血红蛋白变异体的结构，只要在血红蛋白链的N-端，最后一个氨基酸为缬氨酸的任何变异体，它都将它们列入为检测对象。因此，血红蛋白变异体的影响很大。
4、让今天HbA1c检测现状回到临床实验室的现实世界
（1）回顾糖化血红蛋白检测的历史 从Dr. Ranbar发现糖尿病患者有异常的糖化血红蛋白起，他是从电泳图谱上发现的。以后，DCCT的实验室在层析分离的图谱上，观察到HbA1c峰，并相对于未糖化的血红蛋白峰（加上HbA1c峰）计算出HbA1c的百分值。IFCC的HbA1c工作组形成的参考方法，还是采用了HPLC技术分离HbA1c和HbA0六肽，然后再定量的！也是看到了分离图谱。因此，今天的临床实验室为糖尿病患者进行HbA1c检测时，如果仅仅使用免疫检测方法或酶法，可以在自动化仪器上检测速度快、成本低。但是只有一个检测值，无法了解这个值的背后究竟有无血红蛋白变异体。有人借用Dr. Sacks的文章，宣传说，看看这些HPLC的分离图谱，你就可以知道HPLC分离方法的落后！HPLC方法根本无法分离所有血红蛋白变异体对HbA1c的影响，因为很多变异体的分离峰掩盖了HbA1c的峰。其实，我们的实验室同道没有认真阅读这篇论文！如果好好阅读了，你才会有真正的体会。
Dr.Sacks是世界闻名的糖尿病大家，是他们完成了DCCT的著名临床试验，得出了控制血液糖化血红蛋白与糖尿病并发症的强烈关系。他们正是使用离子交换HPLC方法，采取强制标准化措施，得到这样伟大的结论。至今在NGSP的参考实验室内，依然在使用离子交换HPLC方法检测HbA1c，作为NGSP的参考方法。尽管将离子交换HPLC方法列为NGSP的参考方法，但是这些顶级专家早在21世纪初，就已经以综述形式告诫所有实验室，必须谨慎使用离子交换HPLC！今天，面对免疫检测方法的强大优势，他们很快接受了罗氏的Tina-Quant产品为不会被血红蛋白变异体影响的方法。在很多文章中（尤其在近两年），为了解Hb变异体对各种检测方法的影响，将Tina-Quant和硼酸亲和方法（ultra）列为比较方法，充分说明ADA的明确观点。
今天很多实验室依然采用离子交换HPLC的方法作为检测HbA1c方法的首选。为什么？因为它为每个患者样品的检测提供了一张便于判断和使用的层析图。今天的免疫检测方法尽管在多个评价中，被认为很少受到变异体的影响干扰。但是仅仅一个数据，你能让实验室看到什么？它无法让实验室知道，检测的样品有无Hb的变异体。
（2）上海中山医院临床实验室的做法非常值得大家学习。无论是对一致性计划的调查样品定值、还是在日常对患者样品检测HbA1c，他们都首先使用了离子交换HPLC的方法。理由很简单，可以看层析图，做出判断。当一旦层析图显示难以区分时，他们采用免疫方法检测样品，同时以相同样品的糖化白蛋白和近期患者的血糖表现，综合对患者血糖状况和HbA1c结果做出判断。
罗氏Cobas的HbA1c产品说明书写得非常好。它说：作为原则，必须小心注意具有Hb变异体患者的任何HbA1c结果的解释。不正常血红蛋白会影响红细胞的寿命或体内糖化率。在这些情况下，即使分析上正确的结果不反映在正常血红蛋白患者预期的相同血糖控制。在疑似存在某个Hb变异体（如，HbSS、HbCC、或HbSC）影响了HbA1c值和血糖控制间关系时，必须不可使用HbA1c进行糖尿病的诊断。
因此，尽管都认为免疫方法很少受到Hb变异体的干扰。但是，ADA的导则明确指出：只要具有Hb变异体的患者样品结果，不可任意报告结果为临床做出糖尿病的诊断。仅仅一个结果如何看得出有问题?
上海中山医院的做法值得推广。只有先使用离子交换HPLC，发现问题再以免疫方法去比较。这个做法完全符合ADA导则的精神。
随着经济发展、人员在国内充分流动的情况下，原先在我国南方地区的人群在上海也越来越多。生活条件好了，到处都出现越来越多的新糖尿病患者。因此，千万不可马虎，随时警惕Hb变异体对HbA1c结果的影响。越是到南方，问题更严重。
无论你的实验室采用什么方法检测HbA1c，都应该认真学习Hb变异体对HbA1c检测结果的影响。尤其是在选择HbA1c检测产品时，一定要详细了解具体的资料，阅读厂商提供的说明书。使用免疫方法或酶法检测HbA1c的实验室，最好能另外具有诸如离子交换HPLC的产品。它将在确定有无Hb变异体时发挥作用。对于正在使用离子交换HPLC的实验室，你应有诸如免疫方法或酶法的产品备用。一旦在层析图上出现确定为Hb变异体时，使用其他方法比较，并应及时与临床联系。检查患者的糖化白蛋白、近期使用血糖仪自我监视的资料和临床表现等，防止发出错误报告。
针对我国情况，还有很多经济欠好的地区。特别要注意因营养不良、近期有出血事例、近期有输血的过程等。因为这些均会影响红细胞的寿命。对于这样的患者不应使用HbA1c作为糖尿病诊断或监视的指标。应该采取糖化白蛋白、果糖胺、以及直接葡萄糖检测等项目替代，方能避免错误诊断和延误治疗。
（责任编辑：xgh）
