钟金清 厦门莲花医院检验科
在日常检验工作中，利用生化反应曲线尤其是异常曲线来寻找校准失败，质控失控及标本失真的原因及纠正，已经有很多同行探讨过了，也获得了很大成果，但对于很多刚入行的同仁来说，反应曲线到底是怎么回事都不知道，更谈不上利用反应曲线来排除错误了。本文就以我们科室的贝克曼dxc800生化仪的反应曲线来给小白们科普一下到底反应曲线是什么，怎么看反应曲线是否异常。
生化反应以检测的方法学上面大概可以分两大类：终点法及速率法。运用终点法的项目包括：TP，Alb，Ua等，速率法：ALT,AST,ALP,GGT等。两种方法又以与空白吸光度的关系分成若干个子方法，其中市面上的绝大部分生化仪多采用终点法2及速率法1，即：将空白吸光度从反应吸光度中减去也就是在计算吸光度的时候首先去除了空白吸光度的影响和不将空白速率从反应速率中减去。
生化反应：底物A+底物B产物C+产物D，终点法的原理是：检测的项目作为底物A或B，当反应到达平衡时，检测底物的消耗量或者产物的生产量，即可用算出检测项目的量。速率法的原理是：检测的项目作为催化反应的E，在保证底物A和B充足的情况下，在反应还未达到平衡之前，检测底物消耗的速度或产物生产的速度即单位时间内的消耗量或生产量，即可算出检测项目的催化活性，再换算成相应的国际单位。
下面我们就以TP和ALT来解释反应曲线的来龙去脉。
上图是某个项目整个检测过程的时序图，从中我看可以看出反应开始都是先加入主试剂（试剂1)然后再加入试剂2或者样品，然后会读取空白（这个空白可能是试剂1和试剂2的空白吸光度也可能是试剂1和样品的空白吸光度），如果是三试剂会再加入试剂3，紧接着才开始读取反应吸光度。这里有一点要注意：当样品加入时，仪器默认这个时间为0，在样品之前加入的试剂，时间设置为负数，之后加入的试剂时间设置为正数，这一点不同仪器设置的是不一样的。
上图是TP（单试剂）的设定参数，从中我们可以看出第一次加入试剂1（A）300ul，时间默认为-180S，温育84s（180-96）后后-96至-64s读取空白吸光度，0s的时候加入样品，继续温育，304至336s读取反应吸光度。
TP的检测原理：蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相互结合而成的，肽键在碱性溶液中，能与铜离子作用产生紫红色络合物，在540nm有吸收峰，并与蛋白质含量成正比。
蛋白质+铜离子→紫红色络合物
上图为TP的反应曲线，a点（-180s）为试剂1（含铜离子的碱性溶液）加入时间；b-c（-96至-64s）为试剂空白读取时间，对应的-0.086左右为试剂空白；d点（0s）为样品加入时间，此时反应开始，从图中我们可以看出吸光度快速上升，说明该波长（540nm）下检测的吸光物质（紫红色络合物）快速大量生成，并且很快达到平衡；e-f（304-336s）为反应读取时间，对于终点法来说，认定这个时间反应已经到达平衡，这是的吸光度(0.110左右)就是反应的最终吸光度，讲反应吸光度减去空白吸光度就是吸光度的变化值，这个变化值与样品中TP的含量成正比。
上图是ALT的设定参数，从中我们可以看出第一次加入试剂1（A）200ul，时间默认为-180S，同时（-180s）加入试剂2（B）40ul，温育76s（180-104）后-104至-36s读取空白吸光度，0s的时候加入样品，继续温育，80至200s读取反应吸光度。
ALT的检测原理：ALT催化L-丙氨酸的氨基转移，生成丙氨酸。丙氨酸与NADH在LDH的催化下反应生成乳酸和NAD+, NADH在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速度与血清中ALT的活性成正比，在340nm处测定NADH下降速率，即可测出ALT活性。
上图为ALT的反应曲线，a点（-180s）为试剂1（L-丙氨酸，LDH）加入时间，同时（-180s）还加入了试剂2（NADH）；b-c（-104至-36s）为试剂空白（试剂1+试剂2）读取时间，对应的0.800左右为试剂空白；d点（0s）为样品加入时间，此时反应开始，从图中我们可以看出吸光度慢慢下降，说明该波长（340nm）下检测的吸光物质（NADH）慢慢减少，并且一直都没有到达反应平衡（平衡时反应曲线会变成水平线）；e-f（80-200s）为反应读取时间，对于速率法来说，认定这个时间反应还未到达平衡，这时候曲线下降的速度即曲线的斜率样品中ALT的活性成正比。
了解了生化反应曲线，那了解它到底有什么用？怎么让它来帮助我们工作，请查看本文《生化反应曲线应用：别让底物耗尽骗了你》（点击查看）。
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（责任编辑：陈雪礼）
