神奇的扩增曲线，如何看懂这些迷惑曲线背后的故事

作者 | 肖亮博 陈光炼单位 | 广州开发区医院检验科前 言自新型冠状病毒肺炎疫情以来，由于生活、工作、出行等的需要，核酸检测、PCR基因检测技术等医疗专业名词，逐渐被医疗行业以外的人群所熟知。对于我们检验人而言，由于疫情的缘故，需要检验人投入到分子检测的工作中去，因此涌现出来大批的PCR技术检测人员，尽管如此，当有散发的疫情爆发时，依然无法满足需求，这就会导致工作人员的平均工作量增加，从而会遇到各种各样的问题。在工作中遇到的各种各样的，千奇百怪的问题，就是提升自己的各种磨练，这样才能不断增长自己的见识。在这里，笔者想与同道们分享我在实验室工作过程中，遇到的一些关于PCR扩增曲线的异常情况，如有描述或者解释不当之处，敬请各位同仁不吝赐教。我们首先简单了解下什么是PCR？PCR，是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种体外模拟天然DNA/RNA复制的核酸扩增技术，它利用变性-退火-延伸三个基本步骤，重复一定的循环次数之后，就能将我们需要的目的基因扩增放大几百万倍。在日常工作中，我们检验人员需要做的就是对标本进行提取、扩增。当扩增结果出来后就需对图形进行技术分析。比如正常的图形可以是这样的（如图1，两个曲线图为线性曲线，并且经过仪器修饰后的曲线）图1也可以是图2这样的（左侧为对数曲线，右侧为原始曲线）图2虽然不同仪器及不同判读界面会有不同形式的曲线图，但是原理都是一样的，都是根据图形的基线、阈值线进行实验的判读如图3。图3看完上面的正常图形后，我们下面进入正题。案例101问题：标本包括内源性内标不出现明显的扩增曲线。 02分析：标本采集时是否有采到样；进行核酸提取时是否漏加或是因为试剂问题提取不成功。03解决：重新采样检测或是重新进行核酸提取。案例201问题：PCR两个靶基因的扩增曲线呈斜直线型。02分析：出现此种情况可以注意下检测完的反应管里面该孔位的标本是否出现反应液面明显低于其他反应孔位的液面，大多数是由于在分装试剂时分液不准确造成，或是因为实验所采用的PCR反应管气密性较差，在反应的过程中出现了溶液的蒸发引起探针浓度增加，导致曲线呈斜直线上升。03解决：试剂分液时应注意液面是否在同一水平线上，上机检测前应将PCR反应管用力盖严，并仔细检查有无缝隙。案例301问题：从图形可见，某标本三条扩增曲线在第7—11循环之间呈现一个急剧上升的信号飙升的现象，随后三条曲线像是什么都没发生一样又按着“正常”的轨迹继续扩增，结果由于曲线打折后与阈值线相切的缘故，得出“强阳性”的结果。02分析：由于整板其他孔位曲线没有异常情况出现，怀疑可能该孔位溶液有气泡影响：气泡可以让光路发生折射，因此在气泡破掉的时候会导致荧光信号发生急剧的变化，干扰仪器对荧光信号的采集。03解决：检验操作人员在进行核酸提取加样时应注意，避免大的气泡的产生；上机检测前观察溶液是否有气泡的出现，有的话尽量弹掉后再离心上机。案例401问题：基线不平滑，整体扩增信号杂乱，感觉整个扩增效果有点被抑制的情况。02分析：从整体来看整板扩增效果不是特别理想，然而进行样本单独分析时，发现问题仅出现在几个标本身上，这几个标本很多都是处于同一条八联管，抛开这几条有问题的八联管进行分析时其余结果未见异常曲线。03解决：受影响的标本进行复查，结果正常；建议采用质量好的耗材进行实验。案例501问题：荧光信号异常，信号从高到低，波动异常。02分析：实验后发现虽然全部八联管的盖子仍然是盖严状态，但是有些管子里面的液体明显有所挥发，出现异常曲线的标本液体明显少于其他标本。03解决：受影响的标本进行复查，结果正常；建议采用质量好的耗材进行实验。案例601问题：扩增曲线在前几个循环出现了信号明显波动情况，然后趋向于稳定。02分析：前期的PCR过程中，由于试剂和核酸样本没有得到充分的混匀，导致信号的不稳定，等反应了几个循环之后，样本和反应液开始混匀之后，荧光信号就变得稳定。03解决：扩增前确保反应管是否进行混匀之后再离心，如果没有充分的混匀，样本体积占比越大的体系越容易发生这种现象。案例701问题：荧光信号出现负增长。02分析：这种现象是因为基线设置不合理所造成的，一般都是因为整板出现较多DNA浓度偏高的样本，而基线的终点设置大于这些CT值，导致软件出现计算错误。03解决：可以减少基线终点到CT值的前3个循环数，如果不能明确基线起始和终点位置的时候可以先尝试进行自动基线的分析，结果分析合理的话可以使用自动基线的设置。总 结实验做得越多，我们所接触的异常曲线图形的几率就会越多，而这些图形都不会是一成不变的，如何掌握这些异常的曲线分析，是我们检验人以后要努力学习的方向。END
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