编译：微科盟咖啡里的茶，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。导读 世界各地的许多污水处理厂都面临着起泡的操作问题。其特点是在曝气池上形成持久稳定的泡沫，从而降低出水质量。泡沫通常是由一组高度疏水称为分枝杆菌（Mycolata）的放线菌群来稳定的。Gordoniaamarae是最常被报道的起泡成员之一。由于目前尚无处理泡沫的可靠方法，噬菌体生物控制被认为是一种有吸引力的处理策略。从相关发泡细菌中分离出的噬菌体可以在实验室条件范围下破坏泡沫的稳定性。然而，还没有分离出能裂解G.amarae的噬菌体。在这里，我们组装了G.amarae和一个之前未被描述的物种Gordonia pseudoamarae的完整基因组，以检验促进稳定泡沫产生的机制。我们的研究表明，这两个物种通过许多抗病毒机制，包括限制、CRISPR-Cas和噬菌体排斥，对噬菌体感染具有抗性。相反，我们从糖细菌门（Saccharibacteria）中分离并共培养了一种环境超小附生细菌，它可以裂解G.amarae、G.pseudoamarae和其他一些通常与废水泡沫有关的分枝杆菌。这种寄生细菌“Candidatus Mycosynbacter amalyticus”的应用，为稳定废水泡沫的细菌的生物控制提供了一个很有前途的策略。 论文ID 原名：Cocultivation of an ultrasmall environmental parasitic bacterium with lytic ability against bacteria associated with wastewater foams译名：一种对废水泡沫相关细菌具有溶解能力的超小型环境寄生细菌的共培养期刊：Nature MicrobiologyIF：17.745发表时间：2021.04.29通讯作者：Steve Petrovski通讯作者单位：澳洲拉筹伯大学生理、解剖和微生物学系实验设计结果与讨论为了阐明活化污泥中G. amarae行为的基因组机制，我们检测了美国、德国和澳大利亚31年间从稳定泡沫中分离的6个G. amarae菌株 (表1)。这些分离物的16S核糖体RNA基因序列分析揭示了两个簇 (图1a)。第一个包含16S rRNA基因与1974年在美国佛罗里达州分离的CON44T型菌株包括2005年我们实验室在澳大利亚维多利亚分离的BEN368、BEN372和BEN374 (表1) 具有100%序列同一性的菌株。第二组中的菌株与CON44T具有约99.2%的16S rRNA基因序列同一性，包括1984年从德国巴伐利亚分离的CON9和2005年从澳大利亚维多利亚分离的BEN371 (表1)。我们对所有六种菌株进行了全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)，使用Illumina短读和Oxford Nanopore长读技术相结合，然后进行混合组装，产生G. amarae的完整组装体。环状基因组的大小范围从5.15到5.40兆碱基(Mb)，序列读长覆盖长度从82到174倍 (表1)。这些基因组预计包含4401至4695个预测的蛋白质编码基因、3-4个rRNA操纵子和51-55个转移RNA基因 (表1)。BEN371是唯一含有93kb质粒的菌株(表1)。表1 | 本研究中组装了完整的环状细菌基因组6个菌株初步的全基因组比较分析显示，CON9和BEN371与G. amarae型菌株CON44T有显著差异。为了量化这些差异，我们采用了三种基于电子序列的相似性度量方法:基因组到基因组距离杂交(genome-to-genome distancehybridization，GGDH); 平均核苷酸同一性 (averagenucleotide identity，ANI); 平均氨基酸同一性 (averageamino acid identity，AAI)。本研究测序的基因组和其他6种Gordonia的基因组进行两两比较，发现两个聚类的菌株只有约27%的GGDH，约83%的ANI和约85%的AAI (图1b、c和扩展数据图1c)。这些相似性值均低于GGDH (70%)、ANI (95%)和AAI (95%)的种内变异所接受的阈值，且与基因组分类数据库工具包（Genome TaxonomyDatabase Toolkit，GTDB-Tk）分类法的分类结果一致。它们将这些簇划分为两个物种(图1d和扩展数据图1d)。因此，我们建议将CON9T作为该菌株的模式菌株，并将BEN371作为一个尚未被描述的物种，该物种因其形态和化学分类上与G. amarae相似而被命名为Gordonia pseudoamarae。四个G. amarae菌株 (CON44T、BEN368、BEN372和BEN374) 的比对显示了高水平的基因组同源性，大多数主要的基因组差异归因于可移动遗传元件 (MGEs) 的插入 (图1e；黑色方块表示MGE插入)。G. pseudoamarae CON9T和BEN371也是这种情况 (图1e；黑色方块表示MGE插入)。核心蛋白编码序列分别覆盖了CON44T和CON9T型菌株中总预测基因的96% (4533) 和98% (4299) (扩展数据图2a，b)。使用直系同源基因簇 (clusterof orthologous groups，COG)对这些核心蛋白进行功能分类，表明对于CON44T和CON9T大约70%的预测基因是可功能分类的(扩展数据图2a，b)。在CON44T和CON9T中都发现了合成和输出分枝菌酸所需的酶，它们被整合到Gordonia的细胞壁中，并促进活性污泥中泡沫的稳定(图1f，扩展数据图3和补充表1)。我们无法分离出能够裂解G. amarae和G. pseudoamarae的噬菌体，这表明强有力的抗病毒机制保护了这些生物体免受噬菌体的入侵。利用REBASE技术对6株 G. amarae 和G. pseudoamarae基因组编码的限制性内切酶进行了研究，发现每个基因组中都有大量的限制性内切酶 (14-19种预测活性成分)，大多数种内的差异出现是由于BEN371 的MGEs和质粒造成的 (图1 g和补充表2)。作为对照，我们在G. terrae和Gordoniarubripertincta的基因组中寻找限制性内切酶，在撰写本文时已分离出2000多种噬菌体，并在每种基因组中仅发现一种预测的活性限制性内切酶 (图1g和补充表2)。接下来，对活性CRISPR-Cas系统的搜索表明，每个G. amarae基因组包含一个单一的I-U型系统，其中包含20至28个间隔区，而G. pseudoamarae基因组包含两个CRISPR系统，其中I-E型是最活跃的，包含46至138个间隔区 (图1h和扩展数据图4a，b)。在G. terrae和 G. rubripertincta基因组中未观察到CRISPR-Cas系统 (图1h)。此外，在CON9T和BEN371中均观察到噬菌体排斥 (BREX)系统，与Rhodococcus pyridinivorans GF3中存在的最相似 (图1i)。 图1 | 导致G.amarae和G. pseudoamarae在活性污泥中持续存在的基因组决定因素。a .基于来自六个G. amarae (其中两个后来被鉴定为G. pseudoamarae) 的全长16S rRNA基因序列的系统发育重建，使用邻近连接方法证明了两个不同的聚类。 Gordonia terrae 3612T用作外组。条形代表每个位点的核苷酸替代数。b. 代表ANI百分比的热图。c. 对本研究中收集的6个Gordonia菌株的全基因组和6个相关Gordonia物种的基因组进行了百分比GGDH分析。d .基于G. amarae CON44T和G. pseudoamarae CON9T全长16S rRNA基因序列和6个相关Gordonia种 (补充表8) 的系统发育重建。系统进化树是用邻近连接法和自举试验 (1000个重复) 推断的，用最大简约法和最大似然法和自举试验(1000个重复)重建的。实心圆圈表示所有三种方法中都存在相应的节点。T. paurometabola DSM 20162T用作外组。条形代表每个位点的核苷酸替代数。e. G. amarae (上)和G. pseudoamarae (下)的全基因组比对。水平彩色块代表基因组，垂直线代表不同菌株之间的同源区域。黑色的柱子表示MGEs。横条代表以Mb为单位的基因组位置。f. Gordonia的生物合成途径。脂肪酸分别通过脂肪酸合酶I和II配合物进行从头合成和延伸。活化的meromycolate然后与烷基丙二酸酯聚合，生成β-酮酸酯，还原后生成成熟的分枝菌酸（mycolic acid），运输到细胞壁。参与分枝菌酸生物合成的酶 (蓝色) 详见扩展数据图3。g. 预测的限制性内切酶的数量和类型。h，CRISPR系统和CRISPR间隔区，在G. amarae和G. pseudoamarae和另外的物种G. terrae 3612T和G. rubripertincta CWB2中鉴定。i. BREX系统组件在G. pseudoamarae CON9T和BEN371的组织与其最近的邻居R. pyridinivorans GF3的比较。在z这三个基因组中，pglX基因在3’端被破坏，这可能影响BREX功能。 这些抗病毒机制使得基于噬菌体的生物控制策略不切实际。在针对相关物种(如G. terrae CON34)的常规噬菌体分离过程中，我们使用标准噬菌体分离技术(方法)从活性污泥中偶然分离出暂定细菌门Saccharibacteria的一员。“Candidatus Saccharibacteria”成员是专性附生寄生 (或附生寄生)；迄今为止，它们很少能在实验室中培养。与这些先前的报告一致，在没有宿主细菌的情况下，我们无法繁殖这种最初命名为JR1的生物。WGS和组装揭示了长度为1081308个碱基对 (bp)的环状基因组，鸟苷-胞嘧啶含量为50.4% (表1)。高度简化的基因组仅编码1125个预测蛋白质编码基因、43个tRNA基因和一个单拷贝的rRNA基因 (表1和扩展数据图5a)。16S rRNA全基因的比较证实了JR1是“Candidatus Saccharibacteria”的成员，与最近的测序分类单元有95.39%的同源性 (TM7门sp. oral taxon 348，克隆BN036; 扩展数据图5b)。全基因组分析确定JR1最接近的遗传邻居为‘Candidatus Saccharibacteria’GW 2011 _ GWC 2 _48 _ 9，在地下水宏基因组中鉴定 (扩展数据图5c，d)。一般来说，糖细菌之间的基因组相似度与其鉴定的位置有关，与在其他生境中鉴定的基因组相比，在人类口腔中发现的那些聚在一起更近 (扩展数据图5c，d)。我们质疑先前讨论的抗病毒机制是否证明对JR1病毒感染G. amarae和G. pseudoamarae的能力无关紧要。为了测试这一点，在CON44T和CON9T的草坪上发现了一系列稀释的JR1。在48小时内观察到指示细菌裂解的清除和菌斑形成 (图2a和扩展数据图6a)。对宿主范围敏感性的进一步测试确定，JR1能够裂解另外27种跨多个分枝杆菌属的物种，包括Dietzia、Millisia、Nocardia和Rhodococcus (扩展数据图6b)。当在来自其他放线菌属的物种 (包括分枝杆菌属（Mycobacterium）、斯氏菌属（Skermania）、链霉菌属（Streptomyces）和津卡菌属（Tsukamurella）)上测试时，没有观察到裂解，也没有在普通实验室生物 (包括革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli）和革兰氏阳性蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）)上测试时，没有观察到裂解 (扩展数据图6b)。我们建议将JR1确认为以前未描述过的“Candidatus Saccharibacteria”、“CandidatusMycosynbacter” JR1菌株 (以下称为M. amalyticus) 中的一个属和种的成员，命名是因为它具有裂解G. amarae和G. pseudoamarae和其他分枝杆菌的能力。透射电子显微镜 (Transmission electron microscopy，TEM) 显示，M. amalyticus细胞呈卵圆形，长度为452±26纳米，直径为244±20纳米 (图2b)。在细胞内连续观察到多个池状结构 (图2b，白色箭头)；在许多情况下，0.5-1-µm长菌毛从细胞表面延伸 (图2c和扩展数据图7 (黑色箭头) )。为了更好地理解M. amalyticus与其宿主之间的物理相互作用，我们在接种后的多个时间点进行了CON44T和CON9T培养物的TEM观察。M. amalyticus细胞在接种后约5分钟内迅速和明显地附着在CON44T和CON9T丝上 (图2d，黑色箭头)。这些物理相互作用持续了24小时，在此期间，附着在宿主细丝上的M. amalyticus细胞的丰度明显增加，并可能导致宿主裂解 (图2e，f)。扫描电子显微镜 (Scanning electron microscopy，SEM) 证实了TEM观察结果，显示M. amalyticus与CON44T和CON9T丝的物理附着没有明显的定位偏好 (图2g，h，白色箭头)。与人类口腔糖杆菌种类中显示的一致，我们没有观察到在感染过程中有M. amalyticus进入宿主的证据。接下来，我们研究了在液体共培养条件下，M. amalyticus的生长特性和捕食动态。首先，将CON44T培养物以0.1的感染复数 (multiplicity of infection，MOI)接种于M. amalyticus，并在接下来的60小时左右测量宿主和寄生菌的生长。与单一培养物相比，共培养物中的CON44T显示生长率降低，在稳定期测得的OD600降低了38% (扩展数据图8)。定量聚合酶链反应 (Quantitative PCR，qPCR)被用于测定M. amalyticus的拷贝数，并表明在其指数期内倍增时间约为3小时(图2i)。接下来，我们进行了一项旨在模拟连续培养的试验，以观察CON44T和M. amalyticus之间的长期动态。将宿主培养物以增加的MOIs (0.1、1和10) 接种于M. amalyticus，共培养物每48小时传代一次 (约为CON44T单一培养物的早期稳定期)。在试验开始和每次传代结束时，测量共培养物中CON44T (OD600)和 M. amalyticus (qPcR) 的丰度。在第一个48小时 (称为第1代) 后，共培养物显示宿主OD600以剂量依赖的方式显著下降 (OD600减少58-85%)，这伴随着M.amalyticus丰度的增加 (图2j)。我们注意到，在所有共培养物中观察到M. amalyticus的最大浓度 (约5.6 × 109拷贝ml-1)是相似的，这表明宿主可用性可能限制了其在更高MOIs下的复制 (图2j)。在随后的传代中观察到共培养物中CON44T的生长崩溃 (2-4；图2j，黑色箭头)，而M.amalyticus的浓度保持稳定。在第5-7代期间，观察到CON44T共培养物生长略有恢复，但在第8-10代期间，其生长再次受到抑制 (图2j)。这些生长模式与共培养物中M. amalyticus的水平相反，在第5-8代浓度显著降低 (约1.9 × 108拷贝ml-1)，但在第9-10代浓度恢复 (约5.9 × 108拷贝ml-1；图2j)。这种反比关系的周期性可能表明CON44T和M. amalyticus在长期共培养中建立了稳定的捕食者-猎物动态。 图2 | 一种超小型寄生菌 M. amalyticus 的动态和超微结构研究。a .在固体培养基上，将一系列10倍稀释 (106-103p.f.u. ml-1) 的M. amalyticus点样到G. amarae CON44T菌苔上。48小时后，在发现无鞭毛体的区域观察到CON44T的清除，在1×106 p.f.u. ml-1处观察到完全清除，在较低浓度 (1×103–1×104 p.f.u.ml-1) 处可见单个斑块。该图像代表了三个生物学重复。b, c. M. amalyticus的TEM。白色方框代表右边放大显微照片中显示的区域。b. 白色箭头表示细胞内池状区域。比例尺，500纳米和200纳米 (缩放) c. 黑色箭头表示从细胞延伸的菌毛。比例尺，300纳米和100纳米 (缩放)。更多示例显示在扩展数据图7. d–f，共培养5分钟 (d) 和24小时 (e，f) 后CON44T (顶部) 和CON9T (底部) 的透射电镜。f. 显示了潜在宿主裂解的区域。白色方框代表右边放大显微照片中显示的区域。黑色箭头表示附着在CON44T或CON9T细胞上的M. amalyticus的例子。比例尺，2微米和1微米 (已缩放)。透射电镜图像代表了两个独立的实验。g, h. 共培养后CON44T和CON9T的扫描电镜观察。黄色和红色方框分别代表放大的显微照片中显示的左右区域。白色箭头表示与CON44T或CON9T丝结合的 M.amalyticus 的例子。比例尺，3微米和1微米 (已缩放)。扫描电镜图像代表了一个单独的实验。i. 分离的M. amalyticus与CON44T (OD600= 0.05) 共培养54小时，MOI为0.1轴)。M. amalyticus的DNA拷贝数 (qPCR; y轴) 表示大约2.98小时的指数倍相时间。数据以平均值 (实线) ± s.e.m .(虚线) 表示，单个数据点用闭合圆表示 (n = 3个生物学独立实验)。j .分离的M. amalyticus与CON44T(OD600 = 0.05) 共培养，MOI为0.1、1或10，共10代 (x轴)。CON44T (OD600；实线，y1轴) 和M. amalyticus的DNA拷贝数 (qPCR虚线，y2轴) 在时间0和每次随后的传代 (每48小时) 时测量。用CON44T单作 (OD600= 0.05) 作为对照。共培养增长崩溃用黑色箭头表示。数据以平均值(实线) ± s.e.m . (误差线) 表示 (n = 3个生物学独立实验)。 在我们的透射电镜中观察到的菌毛与之前基于基因组的证据相一致，即在其他“Candidatus Saccharibacteria”中存在第四型分泌系统 (T4SS)。为了确定T4SS在这一门中的分布范围，在撰写本文时，我们使用国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI) 提供的所有完整基因组 (26个) 进行了核心蛋白分析。鉴定了153个蛋白质的核心蛋白质组 (≥50% 的AAI阈值；补充表3)；用COG进行的功能分类显示，超过一半的蛋白质 (115) 参与了包括复制、转录和翻译在内的基本过程 (图3a和补充表3)。在按细菌分泌和运动分类的六种蛋白质中，有四种显示出与T4SS蛋白高度同源。其中一种蛋白质被鉴定为VirB4，是先前报道的“ Candidatus Saccharibacteria”32中半保守VirB/ 类D4基因簇的一部分。我们分析了M. amalyticus基因组中其余的三个基因；结果鉴定出2个操纵子，包含21个与IV型菌毛的生物发生和功能相关的基因 (图3b和扩展数据图9a)。对剩余的25个‘ Candidatus Saccharibacteria’基因组的分析表明，这两个操纵子的组织是高度保守的 (图3b和补充表4)。菌毛回缩三磷酸腺苷酶是T4SS的特征，对促进IV型菌毛的抽搐或“抓钩”运动至关重要，它在26个物种中显示出最高水平的氨基酸序列同源性 (74-88%的同源性为M. amalyticus；图3b和补充表4)。最后，我们鉴定了三个预测的菌毛蛋白基因，其产物在初级T4SS操纵子中组装形成菌毛丝，但也检测了分散在整个基因组中的额外预测的菌毛蛋白基因(平均每个基因组总共15个菌毛蛋白；扩展数据图9b)表明它们可能将一系列的菌毛结合到它们的IV型菌毛中。 图3 | IV型菌毛操纵子在‘Candidatus Saccharibacteria’基因组中高度保守。a，包括M. amalyticus在内的26个‘CandidatusSaccharibacteria’基因组的核心蛋白分析。显示了153种蛋白质的COG分类，这153种蛋白质在所有‘CandidatusSaccharibacteria’基因组中被共同鉴定26个‘Candidatus Saccharibacteria’基因组的核心蛋白分析。更多信息请参见补充表3。b, M. amalyticusJR1基因组中发现的两个操纵子的IV型菌毛蛋白基因的基因组组织。这些基因在其他25个Candidatus Saccharibacteria基因组中高度保守。例子包括地下水中的GW2011 (‘ CandidatusSaccharibacteria ‘ GW2011_GWC2_44_17) 和人类口腔物种AC001 (‘ CandidatusSaccharibacteria ‘口腔分类单元488 AC001) 。土壤中YM_S32 (Candidatus T.rhizospherense YM_S32) 是缺乏保守的次生IV型菌毛操纵子的基因组的一个例子。基因下面的值表明了其他25个“Candidatus Saccharibacteria”基因组的基因与M. amalyticus基因组平均百分比的同源性。更多信息请参见补充表4。 总之，我们对6个G. amarae菌株的WGS分析最终揭示了导致G. pseudoamarae分类的种内分化。尽管这两个物种之间存在遗传差异，但它们都进化出了一系列促进它们在活性污泥中过度繁殖的机制。在这项研究中，我们探索了抗病毒系统的遗传决定因素，包括限制性内切酶、CRISPR-Cas和BREX，我们假设它们可以保护这些物种免受噬菌体捕食，促进它们在活性污泥中的增殖。在多次尝试后，我们无法分离出能够溶解这两个物种的噬菌体，这与基因组证据一致，表明基于噬菌体的生物控制方法是不切实际的。“Candidatus Saccharibacteria”门的成员是在多种生境中发现的超小型寄生细菌，包括土壤、地下水、深海沉积物、哺乳动物和废水活性污泥。 M. amalyticus 是该门以前未描述过的环境成员，它在多个分枝杆菌物种中显示了广泛的宿主范围 (扩展数据图10) 。与以前的研究一致， M. amalyticus 不编码氨基酸或脂肪酸的从头合成能力，但其基因组编码一系列参与糖酵解 (Embden-Meyerhof-Parnas)、戊糖磷酸途径和分解一些简单碳水化合物进入这些途径的酶 (补充表5)，这可能为其提供ATP和还原能力以支持其生长。基因组还编码一系列预测的肽酶 (21)、脂肪酶 (10)、聚糖酶 (5) 和脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶 (11；补充表6)，这可能构成其掠夺性方式的一部分。M. amalyticus菌毛的超微结构观察，以及该门T4SS基因的保守性，表明IV型菌毛在‘ Candidatus Saccharibacteria’中起着重要作用。细胞粘附是T4SS被广泛研究的特性，包括假单胞菌属（Pseudomonas）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、奈瑟氏球菌属（Neisseria）和梭状芽孢杆菌属（Clostridium）等许多细菌属利用IV型菌毛粘附靶细胞。此外，蛭弧菌属的附生和胞内捕食细菌需要IV型菌毛才能附着于其细菌猎物。同样地，M. amalyticus可能使用IV型菌毛来识别和附着于其细菌宿主。考虑到IV型菌毛的粘附特性可以通过菌毛蛋白组成来确定，有可能激活由 ‘CandidatusSaccharibacteria’基因组编码的预测菌毛蛋白的扩展序列，以改变宿主范围或结合特性。M. amalyticus的溶解特性表明它可能与其宿主的寄生关系比Candidatus Nanosynbacter lyticusTM7x更密切。共培养研究表明，M. amalyticus极大地减少了CON44T的生长，并有可能参与长期的捕食者-猎物关系。这与先前在长期试验中观察到的口腔“Candidatus Saccharibacteria”类似，除了M. amalyticus似乎更显著地抑制其宿主的生长。这种行为在某种程度上让人想起裂解性噬菌体，表明它可能是废水处理厂泡沫生物控制的候选物。令人鼓舞的是，对已发表的16S rRNA基因测序数据集的重新检查发现了M. amalyticus，尽管在丹麦的污水处理厂中含量很低，这表明它可能会在运行良好的废水处理厂中长期自然存在 (补充表7)。在模拟活性污泥环境方面的进一步实验室规模的工作将决定随着时间的推移，M. amalyticus抑制G. amarae和 G. pseudoamarae的增殖和种群数量，并最终决定其对产生稳定废水泡沫的分枝杆菌的生物控制的潜力。
（责任编辑：dawenwu）
科研 | Nat. Microbiol.：一种对废水泡沫相关细菌具有溶解能力的超小型环境寄生细菌的共培养
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