解决学界数十年的难题，张锋/华克勤/李劲松首次发现先天性生殖管道发育异常的遗传机理

当涉及一个以上基因时，鉴定致病基因突变及其组合是至关重要的，但在剖析复杂疾病的病因方面具有挑战性。Müllerian异常（MA，也称先天性生殖管道发育异常）包括子宫，子宫颈，输卵管或阴道中的多种解剖畸形，这是由于Müllerian导管发育过程中的异常畸变引起的。MA不仅给女性带来不良的生殖能力，也有心理困扰。关于MA的病因，遗传危险因素被认为具有很强的影响力。但是，由于MA个体之间广泛的表型和基因型异质性，因此很难确定潜在的遗传风险因素。多年以来，一直没有发现主要基因解释人类MA的病因，这暗示了MA的遗传复杂性。2019年10月18日，复旦大学华克勤，张锋及中科院上海生化细胞所李劲松共同通讯再Cell Research 在线发表题为”Joint utilization of genetic analysis and semi-cloning technology reveals a digenic etiology of Müllerian anomalies”的研究论文，该研究联合使用遗传分析及半克隆技术，发现GEN1 + WNT9B是MA表现中重要的遗传组合，并首次提示GEN1是MA的主要危险因素。总而言之，该研究为人和小鼠中MA的双基因病因提供了证据，并突出了半克隆技术作为一种快速有效的实验测定方法，用于鉴定复杂疾病的小鼠模型中遗传变异的致病性组合。因此，遗传分析和半克隆技术的联合利用在筛选越来越多的MA致病性变异组合以及其他类似复杂疾病方面具有巨大潜力。当涉及一个以上基因时，鉴定致病基因突变及其组合是至关重要的，但在剖析复杂疾病的病因方面具有挑战性。双基因/几个基因模型，认为一个以上的基因可以协同作用，这些基因模型提高了我们对复杂表型潜在遗传因素的理解，但是缺乏一种快速有效的实验方法来鉴定动物模型水平上的遗传变异的致病性基因的组合。Müllerian异常（MA）包括子宫，子宫颈，输卵管或阴道中的多种解剖畸形，这是由于Müllerian导管发育过程中的异常畸变引起的。MA不仅给女性带来不良的生殖能力，也有心理困扰。关于MA的病因，遗传危险因素被认为具有很强的影响力。但是，由于MA个体之间广泛的表型和基因型异质性，因此很难确定潜在的遗传风险因素。多年以来，一直没有发现主要基因解释人类MA的病因，这暗示了MA的遗传复杂性。到目前为止，先前的一些研究已暗示基因组拷贝数变异（CNV，尤其是基因组缺失）参与了MA的复杂病因学。为了探讨MA的病因，研究人员首先采用比较基因组杂交（CGH）微阵列进行分析25名MA患者的基因组CNV。研究人员发现7/25（28％）的受试者携带稀有和大型（> 100kb）的CNV。由CNV引起的基因剂量变化对于人类发育性疾病的发病机制至关重要。研究人员专注于与MA相关或与女性生殖道相关的基因，并检查了这7位受试者中是否删除了这些基因，最后研究人员发现GEN1，TBX6和LHX1符合要求。为了更系统的探讨其病原学，研究人员又招募了另外100名患有MA的女性，并进行了qPCR分析，以初步筛选上述区域的CNV。研究人员确定了另外6例可能在TBX6 / 16p11.2（4/100）或LHX1 / 17q12（2/100）中缺失的病例。为了验证通过qPCR鉴定出的这些潜在CNV，研究人员将这6例病例中进一步进行了CGH微阵列分析，发现它们确实都是相应的TBX6 或LHX1缺失CNV的携带者。总之，研究人员在125例患者队列中鉴定出9例携带潜在病原性CNV的病例（9/125），并证明其中2例CNV在中国MA病例中复发。有害的遗传变异，例如缺失CNV和单核苷酸变异（SNV），可以破坏基因功能。 CGH微阵列分析可以有效地鉴定涉及CNV的遗传变异，但不适用于SNV。因此，为了全面了解MA的病因，研究人员使用9个CNV携带者的全外显子组测序（WES）检测了SNV。在进一步的分析中，研究人员分别在CNV区域中发现了WNT9B（c.6dupC; p.R2fs * 55）的移码突变和GATA3（c.581T> G; p.M194R）的错义突变。因此，分别在9个CNV携带者中有2个被两次击中（分别是“ GEN1缺失CNV + WNT9B移码SNV”和“ TBX6缺失CNV +GATA3错义SNV”），提示了MA的潜在双基因病因。为了研究变体组合“ GEN1 + WNT9B”和“ TBX6 + GATA3”的致病性，研究人员分别将它们相应的双重杂合变体引入了小鼠。通过使用半克隆技术，对8-11周大的小鼠解剖后发现，Gen1 +/- Wnt9b +/-雌性小鼠（而非Tbx6 +/- Gata3 + / KI小鼠）的子宫表现出比野生型对照组更长的子宫。同样，Gen1 +/- Wnt9b +/-小鼠子宫的直径倾向于偏离正常值，尽管它们的平均值与野生型子宫的直径没有显著差异。与对照相比，超过60％（7/11）的Gen1 +/- Wnt9b +/-雌性小鼠表现出无序的疏松基质结构。这些观察结果表明，Gen1和Wnt9b中的双重杂合突变可能导致小鼠子宫的异常发育，这是女性生殖道的关键组成部分。总的来说，这些在小鼠模型中的实验观察表明Gen1和Wnt9b对子宫的发育具有协同作用，这在小鼠中为MA的双基因病因提供了第一个证据。最后，该研究探讨了MA患者中GEN1和WNT9B中双重有害变异的情况。为此，研究人员对MA队列中GEN1和WNT9B的编码区进行了基因靶向测序。值得注意的是，研究人员发现了另外一个受MA影响的病例（来自M82家族），带有双重有害变异（GEN1中一个，WNT9B中另一个），类似于M45家族中的观察结果。在M45和M82家族中，受MA影响的受试者同时携带GEN1和WNT9B的双重有害变异，而未受感染的母亲和姐妹在GEN1或WNT9B中仅携带单个有害的变异，这与相应突变小鼠的观察结果一致。该结果进一步巩固了MA的双基因病因。有趣的是，研究人员还确定了4名在GEN1中携带单个有害变异体，但在WNT9B中没有候选变异体的受试者，这支持GEN1变异体对MA的遗传贡献。由于GEN1中的单个变体不足以引起人或小鼠的MA，其他基因的有害变体（不仅是WNT9B）可能与GEN1变体协同作用而引起MA，与MA的高度遗传异质性相符。总之，这些结果表明GEN1 + WNT9B是MA表现中重要的遗传组合，并首次提示GEN1是MA的主要危险因素。总而言之，该研究为人和小鼠中MA的双基因病因提供了证据，并突出了半克隆技术作为一种快速有效的实验测定方法，用于鉴定复杂疾病的小鼠模型中遗传变异的致病性组合。因此，遗传分析和半克隆技术的联合利用在筛选越来越多的MA致病性变异组合以及其他类似复杂疾病方面具有巨大潜力。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-019-0243-7
（责任编辑：tqh）