2例新型隐球菌颅内感染患者脑脊液mNGS临床应用分析

作者 | 黄赛林单位 | 广东三九脑科医院检验科01前  言隐球菌性颅内感染是中枢神经系统实质或血管引起的一种炎症性疾病，常发病于免疫功能低下患者，免疫功能正常患者发病率逐渐升高[1-2]。因临床患者早期症状不具典型性和影像学缺乏特异性，临床医生经常对隐球菌感染相关检测技术应用不当和对隐球菌颅内感染认识缺乏警惕性，从而易误诊延诊[3-4]。传统的隐球菌感染相关检测技术日益成熟完善，新兴技术mNGS在临床颅内感染应用中也发挥越来越重要的价值[5]。本文通过对2例新型隐球菌颅内感染患者临床结果分析，探讨mNGS在隐球菌感染中诊断中的应用价值，并结合文献复习分析此类病例的临床特点和实验室项目选择，希望引起关注。现报道如下。02案例经过1患者，男，53岁。因脑室腹腔分流术后5月余，意识不清13天，于3月22日神经外科入院。患者5月前因行走不稳在外院检查提示脑积水，行脑室腹腔分流术，术后意识清，出院后在家可自行行走。13天前患者突发肢体乏力、呕吐，伴意识不清，于外院就诊，查CT提示脑积水加重和肺部感染。3月10日急诊行左侧脑室外引流术，术后肺部感染加重，3月19日行气管切开术，术后患者神志持续昏迷，为求进一步诊治而来我院。入院查体：神志呈昏迷状，不能睁眼，下肢刺痛肢曲，CGS评分4T分（E1VTM3），留置脑室外引流管固定在位，引流通畅，瞳孔等大等圆，直径约2.0mm，对光反射消失，气管切开状态，自主呼吸可，左肺叩诊实音，呼吸音增强，双肺底可闻湿性啰音，四肢肌力检查不能配合，肌张力正常，双侧肱二、三头肌腱反射未见异常，双侧膝、跟腱反射未见异常，双侧Babinski征阴性。入院诊断：1.交通性脑积水；2.脑室腹腔分流术后、脑室外引流术后；3.肺部感染伴左肺实变；4.气管切开术后。实验室指标血常规（3-22）：白细胞18.5×109/L，中性粒细胞比值86.1%，降钙素原0.27ng/mL。经外院先后引流治疗5月余，脑积水引流效果欠佳，目前留置引流管通畅，痰培养提示多重耐药肺炎克雷伯菌，肺部感染给予敏感抗生素头孢哌酮抗感染治疗。因患者不明原因脑积水，会诊后诊断：1.脑积水；2.脑膜脑炎（结核性？）。意识障碍考虑为第四脑室扩大压迫脑干所致，建议进一步完善MRI+增强、脊椎全拼MR+增强明确鞍上池有无强化，下一步加用异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及莫西沙星联合抗结核治疗1～2周再观察脑脊液变化。3月26日患者脑室扩大，头部引流管引流不通畅，急诊行分流管腹腔端外引流术，同时送检脑脊液细胞学检测：细胞总数1200×106/L，有核细胞计数60×106/L，淋巴细胞比值90%，发现真菌（如图1）。图1（瑞姬染色*1000）脑脊液生化：脑脊液蛋白3.42g/L，氯111.9mmol/L，葡萄糖1.9mmol/L，乳酸7.75mmol/L；未做其他病原学相关检测。脑脊液细胞学检测发现真菌临床未引起重视，实验室建议加做墨汁染色（阴性）、隐球菌荚膜抗原试验（阳性，滴度＞80）、隐球菌靶向培养（10天后阳性：新型隐球菌）。头颅MRI提示（3-29，图2）：双侧侧脑室室管膜强化及所见上颈段脊膜增厚、强化，考虑存在感染。图2（头颅MRI-3-29）全脊柱MRI提示（3-29，图3）：1.胸腰骶段水平椎管内多处异常信号影，考虑硬脊膜夹层囊肿形成（不除外合并脊髓疝形成），相应胸11-12水平后方椎管内不除外存在粘连；2.脑干表面、颈髓周缘软脊膜明显增厚、强化，考虑感染可能性大；下段胸髓、脊髓圆锥周缘及马尾轻度线样强化影。图3（全脊柱MRI-3-29）结合临床及相关实验室检查，影像学提示感染。患者接受mNGS检查，送脑脊液微生物宏基因二代测序（结果：新型隐球菌，检出序列数:729条，相对丰度:84.08%，RPM-Rat：1734.63，覆盖度:0.28%。）。临床诊断新型隐球菌颅内感染导致的脑积水，积极给予氟康唑、氟胞嘧啶抗感染，调低头部分流阀压力，间断按压分流阀促进脑脊液引流，后患者病情明显好转，患者意识障碍明显好转。嘱返回当地医院继续抗真菌治疗。03案例经过2患者，男，56岁。因发作性肢体抽搐4月余，于6月15日神经内科入院。患者于1月无明显诱因起病，表现为发作性意识障碍，四肢强直阵挛，右侧肢体稍著，持续数分钟缓解。4月26日再次出现发作，症状基本同前。起病后家属发现患者双耳听力下降、下颌近持续性抖动，末次发作后症状明显加重。外院就诊，予以“德巴金”口服治疗，未见好转。5月19日来我院癫痫科就诊，查头MRI（5-19，图4）检查考虑左侧大脑、双侧桥臂、左侧小脑半球、小脑蚓部、左侧丘脑、双侧枕叶多发异常信号，并颅内软脑膜异常强化。图4（头颅MRI-5-19）5月22日脑脊液细胞学检测：细胞总数66×106/L，有核细胞计数65×106/L，淋巴细胞比值77%。脑脊液生化：脑脊液蛋白5.56g/L，氯109.9mmol/L，葡萄糖1.3mmol/L，乳酸脱氢酶63.9U/L，乳酸3.34mmol/L。神经内科会诊后不排除结核性脑膜炎可能转内科治疗，自免、副肿瘤、脱髓鞘、T-SPOT、寡克隆、寄生虫七项均未见异常，抗酸染色、墨汁染色、革兰染色未见异常，隐球菌荚膜抗原阳性（阳性，滴度＞80），患者接受mNGS检查，送脑脊液和外周血宏基因二代测序结果mNGS都为阴性。临床综合考虑，经验性诊断为结核性脑膜炎，治疗予五联（异烟肼，利福平，吡嗪酰胺，乙胺丁醇，莫西沙星）抗结核、抗癫痫等对症治疗。6月3日脑脊液细胞学检测:细胞总数58×106/L，有核细胞计数49×106/L，淋巴细胞比值60%。脑脊液生化:脑脊液蛋白3.67g/L，氯118.7mmol/L，葡萄糖1.4mmol/L，乳酸脱氢酶71.9U/L，乳酸3.64mmol/L。3.0TMR平扫+增强+灌注（6-3，图5）：颅脑复查，对比PACS图像（5-19MR）现：1.左侧大脑脚、双侧桥臂、左侧小脑半球、小脑蚓部、左侧丘脑、双侧枕叶多发异常信号范围较前缩小，幕上软脑膜异常强化范围较前有所缩小，颅底脑池异常强化范围较前稍扩大，建议继续治疗后复查；2.右侧额颞岛顶叶、左侧额叶片状低灌注表现，考虑为血流灌注减少，建议补充MRA检查。图5 （头颅MRI-6-3）6月7日患者因家中有事强烈要求出院，继续按结核性脑膜炎治疗。6月15日患者仍有头痛，表现同前，未见有发作性肢体抽搐。为进一步诊治遂来我院就诊，门诊拟“1.结核性脑膜脑炎可能性大；2.继发性癫痫”收入神经内科。入院后脑脊液细胞学检测：细胞总数78×106/L，有核细胞计数76×106/L，淋巴细胞比值80%。脑脊液生化：脑脊液蛋白4.32g/L，氯116.9mmol/L，葡萄1.3mmol/L，乳酸脱氢酶70.4U/L，乳酸3.75mmol/L。抗酸染色、墨汁染色、革兰染色未见异常。实验室检测查隐球菌荚膜抗原阳性（阳性，滴度＞80），提示临床需与目前结核性脑膜炎诊断鉴别，延迟隐球菌靶向培养（10天后阳性：新型隐球菌），再次联系测序平台查之前mNGS深度序列结果，发现新型隐球菌序列数2条，覆盖度为0.0005%，因未达到设定阈值，结果为阴性。临床综合考虑隐球性脑膜炎，予以抗隐球菌（两性霉素+氟康唑+氟胞嘧啶）及预防癫痫等对症治疗，同时予以鞘内注射两性霉素治。6月28日复查MR颅脑平扫:对比PACS图像（6-16MR）现：左侧大脑脚、双侧桥臂、左侧小脑半球、小脑蚓部、左侧丘脑、双侧枕叶多发异常信号部分范围较前稍缩小，幕上软脑膜异常强化局部范围较前稍缩小、强化程度较前稍减弱，颅底脑池异常强化范围亦较前稍缩小，建议继续治疗后复查。7月2日复查脑脊液细胞学检测：细胞总数35×106/L，有核细胞计数32×106/L，淋巴细胞比87%。脑脊液生化:脑脊液蛋白2.52g/L，氯129.8mmol/L，葡萄1.7mmol/L，乳酸脱氢酶73.9U/L，乳酸2.38mmol/L。后患者病情好转，相对稳定要求出院，遂予回当地医院继续按抗真菌治疗。04案例分析传统的实验室检测技术对脑脊液进行涂片和培养仍是诊断中枢神经系统感染最常用的方法，也是诊断的“金标准”。涂片包括革兰染色查细菌和真菌、墨汁染色查隐球菌、抗酸染色查抗酸杆菌等，涂片可快速对含一定菌量的标本进行检测，但阳性率低。培养包括普通培养常见菌和靶向培养特殊菌，病原菌鉴定和药敏结果可指导临床诊疗，但培养耗时长且受菌量活性、培养条件和抗菌药物使用等影响阳性率较低[6]。实际上病毒、寄生虫、慢性生长细菌及真菌培养常为阴性，无法满足临床诊疗需求。免疫学方法对病毒类及不能涂片和培养的病原体，通过检测血液或脑脊液中的特异性抗原或抗体间接推断引起感染的病原体，具有一定的诊断价值，但是抗体的产生需要一段时间，因此特异性抗体检测对早期诊断意义不大，不同病原体产生的抗原抗体可能具有交叉反应也影响结果的准确性，另外因为血脑屏障导致抗原抗体不易通过，导致脑脊液含量极低而结果阴性[7]。分子生物学方法可以对病原体进行快速、准确的检测，多重聚合酶链式反应技术能够针对临床常见的感染病原体进行检测，在中枢神经系统感染病原体的鉴别与诊断也发挥重要作用，但是都是基于已知病原菌的基因组序列，所能提供的病原体结果具有一定局限[8-9]。近年来在中枢神经系统感染发现罕见病原体、提高阳性率方面，宏基因组二代测序技术（mNGS）发挥着重要作用。虽然仍需更大样本量的临床试验来检验其检测效能，但目前研究表明在细菌、真菌、寄生虫、病毒的应用效果较好，临床有必要熟悉这个新技术，知晓其优势和局限性[10]。对于该两例中枢神经系统感染隐球菌感染mNGS技术的临床应用分析，笔者认为以下几点需要注意。01颅内感染一定要警惕隐球菌在病例1中神经外科医生对隐球菌感染的认识不足，警惕性不高。本病例中病史较长，脑积水严重，神经外科脑室腹腔分流术处理脑积水问题，却没有及时查找脑积水病因，脑脊液细胞学检测发现真菌，临床未引起重视。在病例2中患者因发作性肢体抽搐4月，只是按癫痫处理症状，也没有及时查找癫痫病因，隐球菌荚膜抗原阳性，临床却未引起重视，导致患者的延诊。因此在中枢神经系统疾病中，我们应该更加注重感染性疾病诊断思维，临床不能忽略了感染可以导致的脑积水和癫痫，而考虑感染时不能忽略了隐球菌的存在。中枢神经系统疾病诊断上，脑脊液细胞学可以提供一定的临床路径[11]，通常可根据脑脊液细胞学和生化指标的变化大致判断感染类型，有时可在脑脊液中发现病原体从而确诊，比如病例1可查见真菌。而病例2在脑脊液细胞学检查大致判断感染类型的前提下，应进行有针对性的病原学检查以明确诊断，却没有进行一系类针对性的检查。02隐球菌感染与结核菌感染鉴别诊断十分重要中枢神经系统感染大多不明原因，病原学检测整体阳性率不高，临床采取经验性治疗多，慢性病原菌不明确情况下，临床经验性治疗又大多采取抗结核治疗，该两例病例前期未得到病原学结果的支持，都采取的抗结核治疗[12]。因此在未有明确病原菌的情况下，需要谨慎鉴别诊断，特别结核菌与隐球菌感染的鉴别诊断[13-14]。隐球菌感染通过墨汁染色、隐球菌荚膜抗原试验及隐球菌培养等常规检测技术可确诊。墨汁染色，真菌培养，隐球菌荚膜抗原测定敏感性和特异性分别为65.95%~100%和98.33%~100%，具有较高的临床诊断价值[15]。隐球菌荚膜抗原测定中胶体金免疫层析法、乳胶凝集试验和酶联免疫法检测抗原对隐球菌脑膜脑炎患者均具有重要诊断价值，其敏感度和特异度均在95%以上[16]。如隐球菌荚膜抗原阳性，重症抢先启动抗真菌治疗，轻症可结合其他方法明确病原学诊断。而隐球菌荚膜抗原阴性排除隐球菌，高度怀疑再测或启用其他方法复测。因此对于高度怀疑隐球菌感染可能，隐球菌荚膜抗原是最佳检测技术。03隐球菌感染不能过度依赖mNGS技术病例1中只有在做了mNGS阳性才考虑到隐球菌感染，而病例2中mNGS阴性，尽管隐球菌荚膜抗原阳性，也未做进一步的检测，未完善隐球菌培养等常规检测技术，笔者认为这是临床对实验室检测技术的认识局限性。该两例病例并不是因为病情复杂，而是因为对隐球菌脑膜炎实验室检查缺乏相应的认识，并且过度依赖mNGS技术，导致的误诊和延诊。mNGS检测的原始数据需要专业人员进行仔细分析，以确定报告中哪些病原菌代表真正的致病病原体，病例2中已检测到遗漏的隐球菌病原体的读图，但其丰度太低，未达到预先确定的报告阈值，所有报告阴性。另外，mNGS因为破壁技术的影响，真菌、结核分枝杆菌等厚壁菌和胞内菌的检出灵敏性较低[17]。在隐球菌感染相关检测技术方面，王芳等发现脑脊液隐球菌荚膜抗原检测阳性率高于mNGS技术[18]。费笑非等建议临床首选胶体金免疫层析法，mNGS可用于早期诊断或排除合并感染[19]。05总  结传统的隐球菌感染相关检测技术能满足临床需求，mNGS技术虽然取得了巨大的进步，仍有一定的局限性，需要不断完善，可作为新型隐球菌颅内感染诊断的补充技术，综合应用可提高隐球菌感染早期诊断。而在感染性疾病诊断上，我们应该更加注重感染性疾病诊断思维，使病原学的各种检测技术为临床感染性疾病诊疗提供重要依据。当然我们期待临床微生物技术越来越发达，临床规范送检指征，实验室优化检测流程，未来mNGS技术在感染性疾病的诊断中必将显示出巨大的临床应用价值。参考文献[1]LUCIA KIOKO HASIMOTO E SOUZA, CAROLINA RODRIGUES COSTA, ORIONALDA DE FATIMA LISBOA FERNANDES, et al. 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