Cell | Mediator发挥功能的新机制

中介因子复合体（Mediator）在酵母中由25个亚基组成，在哺乳动物中含有33个亚基【1】。功能上，Mediator参与Pol II活化的各个阶段，调控转录过程。在转录起始阶段，Mediator与通用转录因子（general transcription factors，GTFs）相互作用，促进转录起始复合物（pre-initiation complex，PIC）的形成【2】和Pol II C端结构域（C-terminal domain，CTD）的磷酸化，Mediator还可促进结合增强子的TFs与启动子区域的转录机器间相互作用。同时，Mediator还可与POLR2M和超级延伸复合物相互作用，调控Pol II的暂停和延伸过程。Mediator在结构上分成头部、中部、尾部和CDK8激酶（CKM）等模块【3】。MED14作为Mediator的骨架，具有促进模块之间相互作用，稳定复合物的功能【4】。头部和中部模块的亚基通过MED14形成一个功能性和结构性的核心，与Pol II相互作用；尾部具有可变性，包含与激活子和抑制子作用的亚基。目前关于Mediator的结构-功能关联都是以酵母对对象研究得到的，在哺乳动物中的作用还有待更多的研究。哺乳动物中含有8个多细胞动物特异性的亚基，而且部分亚基对于体外转录和胚胎发育都是必需的，提示了它们有助于增加高等生物的转录调控复杂性。2019年8月8日，来自美国NIH的Rafael Casellas与科罗拉多大学Francisco J. Asturias在Cell杂志上发表文章A Pliable Mediator Acts as a Functional Rather Than an Architectural Bridge between Promoters and Enhancers，综合运用CRISPR-Cas9筛选系统、降解子实验、Hi-C和冷冻电镜等技术研究了哺乳动物Mediator（mammalian Mediator，mMED）的功能和结构，揭示了mMED尾部模块与核心模块的构象影响mMED-Pol II相互作用。该研究的另一亮点是揭示了虽然Mediator在功能上联系着启动子和增强子，但与传统的认识不同的是，启动子与增强子空间上的联系主要是由cohesin发挥的。研究团队首先运用冷冻电镜技术解析了哺乳动物Mediator（mMED）复合物的结构，整体分辨率达到5.9埃。mMED结构中核心亚基，即头部、中部和MED14的排列与酵母的核心Mediator非常相似。根据mMED的结构定义出非核心区域，并且判定出所有非核心区域都归属于尾部模块。MED14的C端参与尾部模块的锚定，核心-尾部作用界面更为复杂和广泛，其中尾部和头部、中部都有额外的作用。mMED尾部可以分为两个相连的片段：靠近头部（head jaws）并环绕MED14 C端的小片段（～165kDa），包括MED15、MED27/3、MED28、MED29/2、MED30，其中MED15、MED27与骨架亚基MED14相邻；与Sc（啤酒酵母）尾部模块位置相对应的大片段（～380kDa），包括MED16、MED23、MED24/5、MED25，其中MED24的C端和中部模块的亚基MED1相连。为了探究mMED的功能，研究团队利用CRISPR-Cas9在小鼠细胞中敲除Mediator各亚基进行分析。在小鼠B、T、ESCs细胞中的实验表明，88%的亚基在不同细胞中功能一致，15个亚基对细胞的存活是必需的，14个亚基可以纯合敲除不影响细胞存活（non-essential），4个亚基在不同类型的细胞中功能不同，如MED12对B、T的存活是必须的，对ESC则没有影响。其中mMED中对细胞存活是非必需的，又不属于尾部模块的亚基，敲除后仅干扰小部分的基因表达。诱导性敲除骨架亚基MED14导致整个Mediator的失活，细胞周期停止，细胞变小，RNAseq显示转录组整体性下调，下调～7倍。mMED14的敲除导致Pol II和Pol II-S5信号显著降低，与Mediator能够招募并磷酸化Pol II的功能相一致。Mediator复合物对哺乳动物细胞的总体Pol II招募和转录组扩增都是必需的。敲除non-essential的尾部模块的亚基，发现随着亚基敲除数量的增加，被影响表达的基因数量增加。尾部的缺失导致转录组有中等程度的下调（～1.3倍）。被调控基因的启动子平均与10个H3K27Ac+H3K4me1+增强子相关，没有被调控的基因只有6个，说明mMED尾部在转录因子（TFs）和Pol II间形成了一个功能性的桥梁。同时，mMED尾部模块的缺陷导致mMED-Pol II或者mMED-CKM相互作用的增加。这或许能够解释Mediator如何促进TF激活Pol II，TF和尾部亚基相互作用，影响尾部的结构及尾部与Mediator核心的相互作用，进而调控Pol II的活化。最后，进一步研究Mediator在启动子-增强子（P-E）相互作用过程中的功能。Mediator或Pol II（敲除其最大亚基RBP1）敲除显著降低Mediator、Pol II在受调控DNA的分布，但原位Hi-C实验表明敲除Mediator或者对P-E、P-P相互作用几乎没有影响。相反地，敲除cohensin蛋白RAD21不影响Pol II、MED26的招募，但显著降低P-E、P-P相互作用。研究进一步证明Mediator通过间接方式调控染色体的拓扑结构，即Mediator影响DNA甲基化和其他表观遗传修饰，调控染色体可接近性（accessibility），进而调控architectural protein的招募，染色体的拓扑结构。总的来说，此项工作研究并解析了哺乳细胞Mediator的结构和功能，并提出了Mediator发挥功能的新机制，Mediator并不是充当一个拓扑结构上的主要桥梁，而是通过招募其它蛋白间接调控P-E相互作用。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.07.011制版人：珂参考文献1. Soutourina, J. (2018). Transcription regulation by the Mediator complex. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 262–274.2. Schilbach, S., Hantsche, M., Tegunov, D., Dienemann, C., Wigge, C., Urlaub, H., and Cramer, P. (2017). Structures of transcription pre-initiation complex with TFIIH and Mediator. Nature 551, 204–209.3. Asturias, F.J., Jiang, Y.W., Myers, L.C., Gustafsson, C.M., and Kornberg, R.D. (1999). Conserved structures of mediator and RNA polymerase II holoenzyme. Science 283, 985–987.4. Cevher, M.A., Shi, Y., Li, D., Chait, B.T., Malik, S., and Roeder, R.G. (2014). Reconstitution of active human core Mediator complex reveals a critical role of the MED14 subunit. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 1028–1034.
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