Mol Cell | 殷毅等发展新技术显著提高单细胞测序通量

单细胞测序技术有两个主要挑战。第一，由于单细胞DNA含量极低，而利用PCR对模版的指数扩增不够均一，在整个基因组有很多不随机的偏差，致使基因组的一些难扩增的区域在这个过程中容易丢失，另外对单核苷酸位点变异（SNV）和基因组拷贝数变异（CNV）的分析也不够准确，比如如果在PCR的前几个循环中引入了突变，这个突变就会被指数放大。因此，能够对基因组进行线性扩增可以很大程度上帮助克服这些困难。2017年，谢晓亮组的陈崇毅、邢栋和谭隆志利用Tn5转座子在基因组中插入T7启动子，利用体外转录实现了对单细胞基因组的线性扩增（linear amplification via transposon insertion，LIANTI，【1】）。LIANTI用产生RNA而不是DNA拷贝来扩增基因组，RNA不能在后续扩增中提供模版，因此所有的扩增拷贝都来自单细胞基因组本身的DNA，在均一性和准确性方面都有很大提高。但是，LIANTI的方法需要分离单个细胞进行操作，最多只能处理几十个细胞。这种对单个细胞分别进行操作的流程和其在通量上的局限性，即是单细胞测序技术的第二个挑战。2015年，Jay Shendure实验室利用对细胞组合编码（single-cell combinatorial indexing, “sci”,【2】）实现了通量上的突破。该技术首先把细胞分成96组，用Tn5转座子对每组插入不同的第一轮编码（barcode），把细胞混在一起，重新打乱分组，对每25个细胞进行第二轮编码，整个实验的过程是对所有细胞一起操作的，不需要分别对每个细胞进行操作，之后在分析的过程中利用两轮编码的独特组合可以分出单细胞。这种方法可以一次编码和测序几千个单细胞，最早用于ATAC-seq，后来该实验室将此方法推广到了RNA-seq，Hi-C，毕业于该实验室的Andrew Adey也将此方法推广到了DNA-seq和Methyl-seq【3-6】。但是sci的技术的第二轮编码是通过PCR实现的，因此整个扩增的过程是指数扩增，而且两轮编码的通量也限于几千个细胞。2019年9月5日，美国华盛顿大学的Jay Shendure实验室（殷毅为本文第一作者和共同通讯作者）在Molecular Cell上发表文章High-throughput single cell sequencing with linear amplification【7】，将LIANTI中的线性扩增和sci的高通量结合到了一起，并作出了改进，给新研发的sci-L3技术（“sci”, “linear amplification”, “3-level”）带来了三个优点。第一，通过体外转录获得与LIANTI相同的线性扩增；第二，通过三轮编码将通量从几千个细胞提高到了百万个细胞；第三，该技术也可以灵活地用于单细胞基因组测序之外的其他单细胞测序技术，比如对同一个细胞内的基因组/转录组同时线性扩增测序，因此具有可推广性。后两个优点是通过对LIANTI和sci两方面技术细节的改进实现的。本文作者们将基于sci-L3的全基因组测序（ sci-L3-WGS）用于研究不能产生可育后代的种间杂合小鼠的减数分裂过程，这种方法与传统的研究减数分裂的方法相比有三个优势：第一、传统方法通常依赖于对后代的测序，不能用于研究不可育的种间杂交或者因为其他原因的不育个体，单细胞测序可以直接克服这一点；第二、对后代的测序或者之前低通量的单细胞基因组测序，如MDA【8, 9】，MALBAC【10, 11】，LIANTI等方法，只能研究几十到几百个个体或单细胞，本文作者们利用sci-L3-WGS的高通量，通过对>10000个生殖细胞进行单细胞测序，定位了大约87000个染色体交换（meiotic crossover），研究他们在基因组上的不随机分布；第三、染色体交换在减数分裂的过程中起着帮助染色体正常分裂的重要作用，但是之前的单细胞测序方法通常局限于研究成熟的精子细胞，这些细胞已经经过了两轮减数分裂，不能同时分析染色体交换和减数I期染色体分裂中的错误。本文作者们通过分析大量细胞，捕捉到了产生精子的过程中少数只完成了减数I期而尚未进行减数II期的细胞，发现一些细胞发生了减数分裂典型的染色体交换，但是却错误地如体细胞有丝分裂一般进行了均等分裂（equational segregation），这种现象之前在人类产生卵细胞的过程中被描述过，但是只影响个别染色体 【9】，而全基因组减数I期的均等分裂只见于芽殖酵母【12】，这是该现象第一次在哺乳动物细胞中被发现。该现象是否只存在于不可育的种间杂交小鼠中呢？作者们发现在可育的种内杂交小鼠中也是存在的，只是更为少见。该现象是否存在于人类精子和卵子的产生过程中还有待进一步研究。殷毅博士将于2020年在UCLA建立实验室，欢迎对单细胞DNA测序技术开发和应用，尤其是其在遗传重组和DNA损伤修复方面的应用有兴趣的同学申请博士后职位（请感兴趣的同学将CV和感兴趣的研究课题发送至recombinationlab@gmail.com）。殷毅2009年毕业于北京师范大学，后于2015年在Duke University获得统计学硕士和遗传与基因组学博士学位，师从Tom Petes研究有丝分裂中的遗传重组，2015-2019年先后在Harvard University和University of Washington进行博士后训练，师从谢晓亮和Jay Shendure开发单细胞测序技术，并获得Damon Runyon Cancer Research Foundation的资助。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.08.002制版人：珂参考文献1. Chen, C., Xing, D., Tan, L., Li, H., Zhou, G., Huang, L., and Xie, X.S. (2017). Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI). Science 356, 189–194.2. Cusanovich, D.A., Daza, R., Adey, A., Pliner, H.A., Christiansen, L., Gunderson, K.L., Steemers, F.J., Trapnell, C., and Shendure, J. (2015). Multiplex single cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing. Science 348, 910–914.3. Cao, J., Packer, J.S., Ramani, V., Cusanovich, D.A., Huynh, C., Daza, R., Qiu, X., Lee, C., Furlan, S.N., Steemers, F.J., et al. (2017). Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science 357, 661–667.4. Ramani, V., Deng, X., Qiu, R., Gunderson, K.L., Steemers, F.J., Disteche, C.M., Noble, W.S., Duan, Z., and Shendure, J. (2017). Massively multiplex single-cell Hi-C. Nat. Methods 14, 263–266.5. Vitak, S.A., Torkenczy, K.A., Rosenkrantz, J.L., Fields, A.J., Christiansen, L., Wong, M.H., Carbone, L., Steemers, F.J., and Adey, A. (2017). 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