在一项新的研究中，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的研究人员开发出一种方法来提高杜兴氏肌肉营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）CRISPR基因编辑的效率，这可能对优化针对其他疾病的基因疗法产生影响。相关研究结果发表在2019年3月6日的Science Advances期刊上，论文标题为“CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells”。
图片来自UT Southwestern。
这些研究人员利用一种单切割CRISPR基因编辑技术校正小鼠和人类细胞中的一种导致DMD的常见突变。DMD是一种由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）缺失导致的致命疾病。
在对这种技术进行测试时，这些研究人员发现调整CRISPR基因编辑组分的剂量能够显著地改善编辑后的基因产生的抗肌萎缩蛋白的数量。他们进一步发现，这些组分的最佳比例的变化取决于DNA的哪一部分被编辑。
论文通讯作者、德克萨斯大学西南医学中心的Eric Olson博士说，“当我们在抗肌萎缩蛋白编码基因的其他缺陷部分测试CRISPR时，调节我们的组分配方以获得最佳结果可能很重要。这种新的见解可能进一步促进了CRISPR在治疗DMD和许多其他疾病中的应用。”
意想不到的发现
这些研究人员使用的基因编辑技术需要两种组分—一种称为Cas9的酶和向导RNA（gRNA），其中gRNA的功能类似于分子GPS装置，可将Cas9引导到基因组中待编辑的特定DNA序列上，在那里，Cas9切割DNA。
Olson博士的实验室开发了一种通过将Cas9导入到腺相关病毒（AAV）中来编辑抗肌萎缩蛋白编码基因中缺陷部分的方法，其中AAV是一种无害的病毒，可用于将这两种编辑组分递送到细胞中。gRNA已被导入到AAV中以便将Cas9引导到它切割DNA的突变位点上。
这种编辑过程绕过这种突变并使得肌纤维能够产生抗肌萎缩蛋白。Olson博士之前在大型哺乳动物、小鼠和人类细胞的研究中记录了积极的结果。
在这些之前的研究中，Olson团队使用标准的1比1比例的Cas9和gRNA来帮助恢复肌肉中的抗肌萎缩蛋白产量至正常值的90％以上。
在这项新的靶向这个基因的不同部分的研究中，他们发现1比1的比例并不起作用：当被递送到血液中时，抗肌萎缩蛋白产量仅恢复到正常值的5％。
通过反复试验，这些研究人员发现使用10比1比例的gRNA和Cas9允许对抗肌萎缩蛋白编码基因的特定片段进行最优编辑。在接受CRISPR一剂处理的4周内，在具有一种常见的DMD突变的小鼠中大约90％的肌肉和心肌纤维中的抗肌萎缩蛋白产生得以恢复。
论文第一作者Yi-Li Min博士说，“这很令人惊讶。我们总是使用等量的两种病毒来递送gRNA和Cas9，并没有考虑改变它们的比例。”
缺陷的外显子
作为男孩中最为常见的致命性遗传疾病，DMD导致肌肉和心脏衰竭，并导致在30岁出头时过早死亡。
随着肌肉退化，患者被迫坐轮椅，最终因为横膈膜减弱而戴上呼吸器。尽管科学家们几十年来已知道，组成这个较长的抗肌萎缩蛋白编码基因的79个外显子中的任何一个发生缺陷都会导致这种疾病，但是仍然没有有效治疗它的方法。
Olson博士已发表了多项研究，在这些研究中，他的实验室在DNA的关键位点上进行单一切割来校正突变。包括这项最新的专注于剔除外显子44的研究在内，他的实验室已创建了针对DMD患者中五种最常见缺陷的CRISPR技术，其中这五种缺陷导致了全球大约一半的DMD病例。外显子44位于这个基因最常见的突变热点之一，针对这个外显子进行临床治疗可能让大约12%的患者受益。
这些技术迄今为止尚未被批准用于临床用途，但是Olson团队在去年发表Science期刊上的一项研究（Science, 2018, doi:10.1126/science.aau1549，详情参见生物谷新闻报道：重大进展！利用CRISPR基因编辑技术成功地恢复杜兴氏肌肉萎缩症狗模型中的抗肌萎缩蛋白表达）已表明对外显子51进行 CRISPR编辑阻止了狗的DMD进展，这意味着他们朝着这个目标迈出了重要的一步。在进行这种基因编辑的几周内，这种缺失的抗肌萎缩蛋白在狗的整个身体的肌肉组织中恢复：它在心脏中的水平恢复到正常水平的92%，它在横膈膜中的水平恢复到正常水平的58％，其中横膈膜是呼吸所需的主要肌肉。科学家们估计15％的阈值是显著帮助DMD患者所必需的。
Olson实验室正在对狗进行长期研究，以便测量抗肌萎缩蛋白水平是否保持稳定，并确保这些基因编辑不会产生不良副作用。
Olson博士希望下一步就是在人体中开展一项临床试验，这将是德克萨斯大学西南医学中心基因治疗计划旨在在未来几年内推出以应对众多致命性儿童疾病的几项临床试验之一。
Olson博士说，“我们在开展临床试验之前还需开展更多的研究工作，但是看到我们走了这么远，我们感到非常兴奋。”
参考资料：
Yi-Li Min et al. CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells. Science Advances, 2019, doi:10.1126/sciadv.aav4324.
（责任编辑：sgx）
