ABO血型、血管性血友病因子与原发性止血的关系

ABO血型与血栓形成风险之间的关系已被研究多年。然而，直到近年来，ABO影响生理凝血和病理血栓形成的生物学机制仍相对较少原文翻译：ABO血型、血管性血友病因子与原发性止血的关系摘要：大量研究报道了ABO血型与心血管疾病风险之间的显著相关性。这些研究一致表明，O血型个体的血栓形成风险显著降低。然而，ABO影响凝血的生物学机制目前尚不清楚。令人兴奋的近期数据为这些ABO效应是如何被调节的提供了新的见解，并强调了ABO血型组显著影响血管损伤部位的血小板凝块的形成（原发性凝血）。特别的是ABO影响血管性血友病因子(VWF)生物学的多个方面，与血栓形成风险的降低相一致，正常O血型组的血浆VWF水平与非O血型组相比降低了约25%。 此外，O血型组的VWF显示出对ADAMTS13蛋白水解的敏感性增强。最后，初步研究结果表明，O血型组的VWF与血小板相互作用的能力也可能降低。虽然ABO血型对VWF的作用的分子机制尚未完全阐明，但似乎它们在很大程度上是由VWF的N-和O-链聚糖上同时携带的ABO(H)碳水化合物结构介导的。有趣的是，ABO(H)决定因子也在许多不同的血小板表面糖蛋白受体上表达。最近的研究支持ABO血型不仅对VWF有主要的定量和定性作用，而且可能影响血小板功能的特定方面。鉴于与血栓性疾病相关的巨大发病率和死亡率，定义这些ABO作用背后的机制不仅具有科学意义，而且还具有直接的临床重要性。 关键词：ABO血型/血管性血友病因子、血管性血友病/血小板介绍：ABO血型系统最早由兰德斯坦纳在1900年描述。虽然传统上被认为与红细胞有关，但组成ABO血型系统(A、B和H）决定因子的碳水化合物结构实际上在包括血小板和内皮细胞(EC)在内的一系列不同的细胞类型上表达，ABH抗原作为末端糖结构存在于复杂聚糖链的末端。简而言之，9号染色体ABO位点上的A和B等位基因编码A和B糖基转移酶。这些转移酶催化特定的糖残基的添加，从而使前体核心H聚糖结构转化为A抗原(GalNAc a1®3 [Fuc a1®2] Galb 1®4 GlcNAc b1®) , 或 B抗原 (Gal a1-3 [Fuc a1-2] Galb 1-4 GlcNAc b1-) , （图1）因此，A和B的结构差异仅在于一个末端糖部分(分别是N-乙酰半乳糖胺和D-半乳糖)。O血型组个体缺乏任何A-或B-转移酶活性，因此继续表达基本的H聚糖结构在其低聚糖链的末端。ABO血型在输血和移植实践中的中心重要性已被确立。有趣的是，ABO血型和各种其他疾病之间的显著关联也已被描述。这些疾病包括十二指肠溃疡、胃癌和许多不同类型的脓毒症（如幽门螺杆菌、伤寒沙门氏菌和恶性疟原虫）。最近的研究表明，ABO血型也影响对严重covid-19感染的易感性。大量研究报道，ABO也是心血管疾病和静脉血栓栓塞(VTE)的重要独立危险因素。此外，全基因组关联研究(GWAS)已经表明，ABO血型不仅是动脉粥样硬化发生的危险因素，而且在急性冠状动脉综合征和心肌梗死的发病机制中也很重要。此外，临床研究表明，O血型组患者的梗死面积和总死亡率显著降低。尽管有这些数据，ABO类型决定血栓形成风险的生物学机制目前尚不清楚。ABO血型与凝血功能之间的关系在60多年前首次被提出。在这篇文章中，我们回顾了最近积累的数据，为ABO类型如何直接影响原发性凝血提供了新的见解。特别是，我们考虑了ABO血型影响关键凝血糖蛋白血管性血友病因子(VWF)生命周期的多方面方式。VWF糖基化在正常条件下，VWF的体内生物合成仅限于EC和巨核细胞。这种生物合成包括复杂的翻译后修饰，在VWF分泌到血浆之前完成(图2A)。在内质网(ER)中，VWF单体通过形成C端二硫键组装成二聚体。随后，在高尔基体中，VWF二聚体被组装成高分子量的多聚体(HMWM)。因此，等离子体VWF作为一系列非均质低聚物存在。VWF的翻译后修饰也包括显著的糖基化。这种糖基化具有直接的临床意义，因为在VWF上表达的低聚糖结构调节其生物活性的多个方面。糖基化始于内质网，在二聚化之前，高甘露糖低聚糖被添加到VWF单体中特定的天冬酰胺残基(N-连接位点)中。当VWF通过高尔基体时，这些N聚糖被修饰以产生复杂的分支碳水化合物结构。同时，O-链糖基化发生，这涉及到在VWF中特定的丝氨酸和苏氨酸残基中添加更简单的聚糖结构。因此，VWF单体包含13个N链和10个O链聚糖，位于成熟单体的特定位点(图2B)，低聚糖几乎占最终单体质量的20%。   利用蛋白印迹和序列糖苷酶消化对VWF聚糖结构的初步研究表明，唾液化的双触角链约占VWF上所有N-链聚糖的80%。相比之下，二乙酰化的核心1的四糖结构(称为T抗原)占O-聚糖总数的70%。最近，人们对人类血浆浓缩物进行了质谱(MS)研究，以确定人类VWF的N-和O-糖基体的图谱(图2C)。这些MS数据揭示了VWF碳水化合物结构之间的显著异质性，这可能部分归因于这些研究中使用的浓缩VWF。超过100种不同的N-聚糖组成已经被描述出来。重要的是，MS研究进一步表明，在VWF上不同位点表达的聚糖结构的主要类型存在显著差异。例如，复杂的四触角链在VWFA2结构域的N1515和N1574处更为常见。相反，较简单的双触角链分别位于D3结构域(N1147)和D4结构域(N2223和N2290)的N-聚糖位点。与分布在VWF单体上的N-聚糖不同，10个O聚糖中的8个(T1248、T1255、T1256、S1263、T1468、T1477、S1486、T1487)聚集在A1结构域两侧的两组(图2B)。此外，VWF的O-聚糖通常以短粘蛋白型结构的形式存在。然而，最近的多发性硬化症研究又一次显示了这些O-链碳水化合物之间存在显著的异质性。已经描述了18种不同的聚糖结构，包括核心1和核心2结构。核心1结构通常是小的聚糖，其中Galβ1-3GalNAc-与丝氨酸或苏氨酸残基相连。相比之下，核心2结构具有一个额外的非乙酰葡萄糖胺分支，附着在核心1聚糖上(图2B)。不同类型的碳水化合物链已被证明优先表达在VWF上特定的O-连接位点。例如，核心2聚糖结构更常见的集群O聚糖位于C末端A1域(T1468、T1477S1486T1487)。这些新的见解强调即使在正常健康个体，血浆VWF可能在许多不同的位点以特定的糖基化形式循环。VWF聚糖上的ABO(H)血型结构 先前的研究表明，共价连接的ABO(H)血型决定因子在人类VWF的N-和O-聚糖上都以末端残基表达(图3A和3B)。总的来说，大约15%的VWF N-聚糖和1%的O-聚糖携带ABO(H)结构。除VWF、FVIII和a2-巨球蛋白外，很少其他循环糖蛋白携带ABO(H)结构。质谱分析表明，ABO(H)的表达并不局限于特定的VWF结构域。而是分布在除N1147外的所有N-糖基化位点上。在N1515、N1574和N2365处观察到的N-连锁ABO(H)表达水平最高(图3C)。相比之下，N857、N2290和N2585代表的是低聚焦的位点，仅包含1-3%的ABO(H)结构。虽然正常血浆中存在合成ABO(H)结构所需的特定糖基转移酶，但对ABO不匹配骨髓移植患者进行的分析表明，ABO(H)决定因子可能在EC分泌之前就添加到VWF中。血浆VWF上定量ABO(H)的表达水平受多种因素的调控。首先，A和B抗原在VWF上的装载受到ABO基因型的影响，与纯合子个体(AA或BB)相比，杂合子(AO或BO)的表达显著降低。其次，位于不同血管床的EC合成的VWF上携带的ABO(H)数量存在显著的异质性。第三，去氨加压素（DDAVP）给药后立即分泌VWF的A和B决定因子负荷显著升高。DDAVP触发EC内WeibelPalade小体中存储的VWF的分泌，并被广泛用于VWD的治疗。最后，由于尚未定义的原因，A和B决定因子在血小板a-颗粒中存储的VWF上不表达。考虑到共价连接的ABO(H)血型决定因子在几种血小板膜糖蛋白上携带，这一观察结果是有趣的(包括GPIb、IIb、IIIa)。由于A和B抗原表达了这些其他的血小板糖蛋白，因此很明显，巨核细胞具有血型抗原组装所需的所有糖基转移酶。然而，巨核细胞内VWF的翻译后修饰途径与EC中明显不同，因此VWF聚糖不受这些A和B糖基转移酶的影响。ABO血型影响血浆VWF：Ag水平血浆VWF抗原(VWF：Ag)水平在正常人群中变化很大(正常范围约为50-200IU/dL)。这种变异具有直接的临床意义。VWF：Ag水平降低是最常见的遗传性出血疾病血管性血友病(VWD)。相反，血浆VWF：Ag水平升高(>150IU/dL)构成了血栓形成的剂量依赖性危险因素。对双胞胎的研究表明，血浆VWF：Ag水平的66%是由基因决定的。此外，这种基因对VWF水平的30%归因于ABO血型的影响。ABO对血浆VWF的主要影响：Ag水平由普雷斯顿和Barr在1965年首次报道，随后在涉及各种不同种族的研究中被多个独立小组证实。从这些研究中可以清楚地看出，正常的O血型组个体的血浆VWF：Ag水平比非O血型组个体低约20-30%。尽管在不同的研究中，在非O血型组中已经报道了一些差异，但AB血型组的个体往往具有最高的血浆VWF：Ag水平。ABO血型对血浆因子VIII(FVIII)水平也有类似的影响，尽管这些影响似乎主要是通过VWF水平的变化来决定的。ABO对血浆VWF：Ag水平的影响程度是显著的，因为ABO(H)聚糖决定因子仅在单个末端糖部分有所不同，并且仅在VWF的少数N-和O-联聚糖上表达。除了ABO表型与VWF水平之间的关联外，最近的研究表明，ABO位点的基因型也对VWF有定量影响。因此，携带O等位基因(AO或BO)与AA、BB和AB的杂合子个体相比，VWF：Ag水平显著降低。此外，与O血型组对照组相比，具有罕见的孟买血型表型(其中H抗原不表达)的个体的血浆VWF：Ag水平显著降低。值得注意的是，一些报告也描述了分泌型血型位点和血浆VWF：Ag水平之间的弱关联。这很有趣，因为分泌型血型与ABO有关，因为它也被定义为碳水化合物链上有无特定的末端糖部分。然而，与观察到的血小板-VWF不携带共价连接的ABO(H)决定因子，血小板-VWF水平不受ABO血型组的影响。  ABO和血浆VWF：Ag水平之间的关系对于定量VWD的诊断具有重要的临床意义，其中O组个体显著过多。这种O组的优势在诊断为低VWF水平(范围为30-50IU/dL)的患者中尤为明显。综上所述，这些数据建议在诊断VWD时应考虑ABO特异性参考范围 。重要的是，尽管有这种ABO调节VWF水平的生物学机制(s)尚未被明确定义。然而，很明显，ABO位点在确定VWF聚糖的ABO(H)决定因素负荷时的剂量效应与它对血浆VWF：Ag水平的影响相似。  除了ABO血型在调节血浆VWF：Ag水平方面的影响外，种族也被证明有额外的影响，白种人的水平显著低于非裔美国人。据估计，这种影响占VWF水平总方差的7%。ABO表型的患病率在不同的种族/民族群体之间也有所不同。例如，在美国，O组在西班牙裔（56.5%）、北美印第安人（54.6%）和非西班牙裔黑人（50.2%）中的患病率高于非西班牙裔白人受试者（45.2%）。然而，尽管ABO分布存在种族间差异，线性回归分析表明，种族对VWF：Ag的影响独立于ABO效应。ABO血型及VWF功能活性多年来，VWF辅助因子活性(VWF：RCo)一直被用于评估VWF功能。在本实验中，核素与VWFA1结构域结合，使VWF在静态条件下与血小板Gp1b相互作用，从而触发血小板凝集。尽管VWF：RCo广泛使用，但RCo检测显示了显著的流产间和流产内变异系数(CVs)。先前的研究表明，VWF聚糖结构的修饰显著影响其生物活性（图4）。特别是，ABO(H)血型决定因子在调节VWF血小板相互作用中的特定作用已被提出。Sarode等人从新鲜冷冻血浆中纯化了ABO特异性的VWF，用Azyme(a-N-乙酰半乳糖三酰胺酶)消化后，从A组VWF中去除A抗原决定因子与VWF辅助因子活性(VWF：RCo)显著降低（>30%）相关。用Bzyme（a-半乳糖苷酶）治疗B组VWF的效果相似。相反，这些消化并没有导致VWF胶原蛋白结合活性(VWF：CB)的任何降低，这表明VWF多聚体的分布没有受到影响。对照实验表明，A组VWF的处理与Bzyme或B组VWF与Azyme与VWF：RCo的任何降低无关。基于这些发现，作者推测AB抗原的表达可能在使VWF与血小板相互作用方面发挥作用。尽管这些数据的临床意义尚不清楚，但一些对健康对照组进行的研究已经报道了ABO血型对VWF功能测定的不同影响(包括VWF：RCo和VWF：CB)。其中一些研究报告了相互矛盾的结论，这可能部分与所使用的不同类型的分析条件，以及种族起源的差异有关。最近的研究定义了VWFA1结构域(特别是D1472H)的多态性，这降低了VWF与核素结合的能力。因此，这些多态性与降低VWF：RCo实验室结果相关，但与血浆VWF功能活性的任何显著降低无关。重要的是，D1472H在普通人群中（特别是在非裔美国人）中很常见，因此可能混淆了之前一些队列研究的结果，这些研究试图调查ABO(H)表达对VWF的影响是否有任何功能影响。除了VWF在维持正常凝血方面的既定作用外，最近令人兴奋的研究已经确定了VWF的一系列新的生物学作用。例如，VWF已被证明在抑制血管生成、促进伤口愈合、和促进肿瘤细胞凋亡方面发挥重要作用。此外，越来越多的证据表明，VWF在调节先天免疫反应和脓毒症的不同方面中也发挥着重要作用。鉴于先前的关联研究数据表明ABO血型参与了各种疾病的病理生物学，研究VWF的这些新作用是否在这一背景下相关将是很有趣的。此外，还需要进一步的研究来具体研究VWF聚糖(包括ABO(H)表达)如何影响这些新兴的新的生物学功能。ABO血型和VWF蛋白水解在血浆中，VWF以一系列异质多聚物的形式循环。多聚体的分布需要被严格调控，因为它是VWF活性的一个关键决定因子。高分子量多聚物(HMWM)与胶原蛋白和血小板GpIbα结合，具有增强的亲和力。在正常情况下，VWF多聚体分布受ADAMTS13（具有血栓蛋白1型重复序列的分解素和金属蛋白酶）调控，它在VWFA2结构域内特定的Tyr1605-Met1606键上切割。在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)中，ADAMTS13缺乏与循环病理超大型VWF多聚体和血栓性微血管阻塞有关，这一事实强调了调节VWF HMWM分布的生理重要性。相比之下，由于蛋白水解增强而导致的正常HMWM VWF损失与2A型VWD的显著出血表型相关。先前的研究表明，碳水化合物结构在调节VWF对ADAMTS13以及包括纤溶酶在内的许多其他蛋白酶水解的敏感性中发挥着重要作用。最近，越来越多的证据表明，在这一背景下，ABO(H)决定因子在人类VWF上尤为重要。Bowen是第一个报道与非O血型的VWF相比，ADAMTS13裂解更快的学者(图5A)。在其他非O血型组中，对ADAMTS13的敏感性也观察到B > A ³ AB级的差异。随后的研究证实了这一初步观察，并报道ADAMTS13蛋白水解在不表达的个体中，ADAMTS13蛋白水解显著增强。此外，VWF N-聚糖的α2-6末端唾液化在调节ADAMTS13蛋白水解中的作用。迄今为止，ABO(H)和VWF上的其他碳水化合物结构调节对ADAMTS13的敏感性的机制尚未阐明。然而，有趣的是，两个保守的N-链聚糖位点(N1515和N1574)位于ADAMTS13裂解位点附近的VWFA2结构域(图5B)。定点突变研究表明，N1574位点的聚糖在保护VWF免受ADAMTS13蛋白水解方面具有特殊作用。此外，最近的扫描荧光法研究表明，N1574糖基化在稳定A2结构域的抗展开过程中发挥了作用。综上所述，鉴于ABO(H)血型决定因子作为复合物N1574聚糖链上的末端糖部分强烈表达，O血型组VWF对ADAMTS13蛋白水解的敏感性增强，这一事实提示O血型组血个体可能对TTP有部分保护作用。与O血型组相关的血浆VWF:Ag水平降低在这种情况下也很重要。最近的一些研究已经调查了这一假设。一些小型回顾性研究报告称，O血型组在其TTP队列中的分布低于预期，尽管这并没有达到统计学意义。然而，一项更大的前瞻性研究连续招募了301名TTP患者，得出了相互矛盾的结果，认为O血型组没有保护作用。相反，Terrell等人发现O型血是与严重ADAMTS13缺乏相关的TTP的独立危险因素。尽管这种矛盾的ABO效应被证明与种族/民族无关，但支持这种关联的病理机制仍有待确定。 ABO血型及VWF清除率ABO血型影响血浆VWF：Ag水平的机制尚未明确。理论上，这种定量效应可以归因于EC内VWF生物合成的相关差异。另外，ABO可能会影响体内VWF血浆清除率。体外研究直接研究ABO是否影响VWF的生物合成具有挑战性，因为体外表达的VWF上的聚糖结构与人血浆VWF上的聚糖结构不同。然而，目前的证据表明，ABO血型对EC中VWF的合成或分泌率没有显著影响。研究表明，(i)ABO血型对血浆VWF前肽(VWFpp)水平无影响；ABO不影响血小板VWF：Ag水平；(iii)ABO对DDAVP给药后的VWF分泌量无显著影响。相反，最近积累的数据支持这样一种假设，即ABO(H)血型对血浆VWF：Ag水平的影响主要是由于血型间VWF清除率的差异。例如，加利纳罗等人的研究表明，DDAVP给药后VWF分泌的半衰期受到ABO血型的影响。特别是，O血型组的VWF半衰期明显短于非O血型组个体（分别为10.0小时和25.5小时）。与这些发现相一致的是，在O血型组受试者中，VWFpp：VWFAg比值（内源性清除率的替代标记物）也显著升高。最后，研究表明，O血型患者比非O血型患者FVIII的半衰期明显缩短，ABO效应可能与VWF内生的清除率的差异有关。。最近的研究为参与VWF清除的途径提供了重要的新见解。Lenting 等人研究表明放射性标记的VWF主要针对肝脏，并且VWF与CD68+VWF巨噬细胞共定位。随后的体外研究证实，巨噬细胞以剂量依赖的方式结合VWF，巨噬细胞结合后，会发生VWF的摄取和降解（图6）。最近的研究表明，肝窦性EC(LSECs)也有助于VWF的清除。此外，增强的VWF清除已被证明在VWD的发病机制中发挥了关键作用。尽管有这些数据，但支持O血型组VWF增强清除的生物学机制仍不清楚。重要的是，研究表明，VWF的清除不受VWF多聚体大小的影响，因此不依赖于ADAMTS13蛋白的水解。因此，O血型组个体对ADAMTS13蛋白水解的敏感性的增强和清除率的增加似乎是两种独立的现象。在这种背景下，有趣的是，Groeneveld等人最近报道了ABO对VWF-/-小鼠中的VWF的清除有显著的影响。然而，重要的是，小鼠并不表达A和B的决定因子。此外，与内源性小鼠VWF相比，或者与人类VWF的正常半衰期进行比较，小鼠体内的VWF清除率显著增强。此外，一些涉及调节人类VWF清除的受体(包括CLEC4M和Siglec5)在小鼠中不表达。许多C型凝集素受体参与了调节VWF的清除，包括唾液糖蛋白(ASGPR)、巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL)、和CLEC4M（图6）。凝集素受体的细胞外区域都包含碳水化合物识别域，它们与糖蛋白上的特定碳水化合物决定因子相互作用。尽管VWF唾液化在保护VWF免受清除方面至关重要，但迄今为止，没有证据表明ABO(H)碳水化合物影响与这些凝集素受体的结合。此外，一些清除受体也被证明与VWF结合，包括低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)、清除受体a类成员I(SR-A1和stoboin-2(STAB2)（图6）。最近的研究强调，A2结构域的N1515和N1574的聚糖结构通过巨噬细胞LRP1清除受体清除，影响VWF的半衰期。需要进一步的研究来确定VWF上的N-连锁ABO(H)决定因子是否可能通过这一途径影响体内的生理清除。ABO血型及血小板功能虽然ABO血型决定因子不在血小板-VWF的N-聚糖上进行，但研究表明，它们在许多不同的血小板膜糖蛋白和糖脂上表达。在糖蛋白表达ABH抗原GPIb，IIa，IIIa，IV和V以及血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)，在促进血小板凝块的形成和血管损伤方面，VWF扮演着关键作用，作为桥梁使内皮下胶原蛋白和特定受体表达在血小板的表面。一旦VWF在剪切应力条件下被栓系，它就能够与血小板表面的GPIb-IX-V和GPIIb-IIIa复合物相互作用。观察到ABO(H)聚糖也在这些表面受体上表达，这导致了ABO血型也可能通过影响血小板功能来影响原发性凝血的假设。这一假设得到了最近一系列证据的支持。首先，作为特发性血栓形成的遗传分析(GAIT-2)项目，GWAS研究进行识别因素影响主要凝血测量使用血小板功能分析仪(PFA-100)系统(西门子医疗诊断，马尔堡，Germany)。PFA-100是一个自动化仪器开发来评估高剪切体外凝血。简而言之，全血分别通过胶原蛋白和二磷酸腺苷(Coladp)或胶原蛋白和肾上腺素(Colepi)包裹的孔吸入。在剪切条件下，这些激动剂会触发血小板凝块形成，从而导致孔径阻塞。已知PFA-100关闭时间受到血小板数量、血小板功能、VWF：Ag水平和VWF活性等变量的影响。GAIT-2结果显示，9号染色体上的ABO位点是Col-Epi和Col-ADP中PFA-100关闭时间的主要决定因子。在ColEpi实验中，所有的ABO效应均可归因于血浆VWF-FVIII水平的变化。相反，在Col-ADP实验中，ABO的影响只能部分用VWF-FVIII水平来解释，这表明其他的ABO依赖的机制可能也很重要。   最近的数据表明，GPIb上的ABO表达可能影响该糖蛋白与VWF相互作用的能力。Dunne等人在动脉剪切条件下将全血灌注于固定的VWF上，然后使用视频显微镜评估O型血小板与非O型血小板的易位动力学。有趣的是，他们观察到，在这些条件下，O型血小板与VWF相互作用的能力显著降低。总的来说，O型血小板在与VWF形成稳定连接之前，会在VWF表面移动得更远，并且以显著更大的易位速度移动。此外，与非O血型组血小板相比，O血型组血小板稳定粘附在VWF表面的O血型组血小板的比例明显降低。随后的分析模型表明，在不同的ABO血小板类型之间观察到的差异可能与GPIb-VWF结合动力学的改变有关。然而，ABO影响血小板GPIb生物学的机制尚未明确。还需要进一步的研究来研究其他血小板膜受体上的ABO(H)表达是否会影响其功能活性（如与胶原蛋白或纤维蛋白原相互作用的能力）。然而，ABO对血小板功能的影响可能导致低VWF水平O血型组患者的出血增强。尽管存在这些问题，但有趣的是，之前的一些研究已经表明，正常A和B个体的血小板表面的A和B抗原水平显著增加。据估计，这些ABO高表达的受试者占正常A或B组人群的7%。血小板表面糖蛋白上A和B决定因子的过表达是否具有任何生理或病理意义尚不清楚。结论总之，ABO血型与血栓形成风险之间的关系已被研究多年。然而，直到近年来，ABO影响生理凝血和病理血栓形成的生物学机制仍相对较少。随着最近的进展，特别是在MS糖组分析方面，在这个临床重要的领域已经取得了令人兴奋的进展。F2AF2BF2cF3
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