一、流式细胞术在基础血液学中的应用
(一)血细胞的计数和分类研究 1.红细胞的计数、分类及其功能的研究 (1)循环的红细胞总量的测定: 生物素—逆转抗生物素蛋白—FITC系统的特异性和流式细胞 仪(FCM)的敏感性结合起来,建立了FCM测定人红细胞总量的方法,此方法具有标本用量少,无放射性的优点,适用于儿童和孕妇测定循环红细胞总量。 (2)网织红细胞总数: 外周血网织红细胞计数(百分数和绝对值)是一反映骨髓红系增生活性的常用指标。许多学者先后提出应用FCM和不同的RNA特异性荧光染料自动计数网织红细胞的方法,如派若宁Y、AO、溴化乙啶、thiazole orange等。 目前最普遍应用的是 thiazoie orange 染色法,这种特异性RNA 的激发波(488nm)测量的特点,与人工计数法相比,它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值,而且还能获得网织红细胞成熟指数(RMI)。RMI是一个检测骨髓功能的独立实验室指标,它与网织红细胞内RNA含量成正比,RMI可成功地用于评价骨髓移植的效果。 目前,FCM检测网织红细胞主要用于 1)预测骨髓移植的效果; 2)解释各种红系增长低下性贫血的发病原因; 3)评价某些新的重组生物制剂的治疗效果。 2.白细胞计数、分类及其功能的研究 (1)白细胞计数和分类 FCM方法避免常规染色过程中,由于细胞漂洗和分类溶解所致的人工假象,提供了可靠的评价血液状态的第一手资料,并进一步筛选细胞亚群、测定其他参数。LDS-751、CD45、thiazole orange (2)中性粒细胞的功能 FCM可在单个细胞水平上定量测定中性粒细胞的功能变化,有助于了解白细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性疾病的作用和诊断意义。(3)血小板功能的研究: FCM可检测血小板膜抗原,如CD41a、CD42b、CD36、CD62p、CD63等。应用流式细胞术检测这些单克隆抗体的变化可用于: a、评价血小板功能状态; b、探测循环血液中激活的血小板; c、探测血小板自身抗体。 如对原发性血小板减少性紫癜、慢粒急变和再障病人的血小板自身抗体的检测中发现,病人均可探测到IgM型自身抗体,有的病人可同时伴有IgM或IgA自身抗体,后者血小板减少更明显。因此,IgG血小板免疫荧光检查是检测自身免疫反应的敏感和特异指标,它可直接测定自身免疫性血小板减少病人的血小板表面免疫球蛋白,进行血小板交叉配型,以此为有自身免疫反应的病人选择合适的供血者。(二)正常骨髓各系血细胞特点的研究 1.造血干细胞的特点: FCM多参数分析可以探测常规形态检查方法不能确认的造血干细胞。 2.红细胞系统的特点: FCM系统地观察了红系统表面特异性抗原(Hle-1、CD71和Glycophorin A)核酸及红细胞体积的变化来研究红系在正常骨髓分化成熟的规律。Glycophorin A常作为红细胞晚期的特征,出现在有核红细胞,此时可与体积相似的淋巴细胞进行鉴别,Glycophorin A在成熟红细胞达到最大值,不再随红细胞的成熟而变化。CD71表达介于Hle-1和Glycophorin A之间,在Glycophorin A出现之前,达到最大值。Hle-1主要表达在最早期可鉴别的红细胞上,随着红细胞的成熟而逐渐减少,红系随着成熟细胞体积逐渐减少的物理特点,可由FCM的前向散射光来测得。另外,在CD71和Glycophorin A成熟红细胞中,DNA含量逐渐减少,以至只含有RNA,失去CD71成为成熟红细胞。 3.粒细胞的特点 (1)区别正常粒细胞和白血病克隆; (2)确定白血病是以粒系为主,还是以单核细胞为主; (3)探测粒细胞白血病的异质性。 4.巨核细胞的特点 应用FCM同时观察巨核细胞的体积,内部结构,DNA含量以及膜表面抗原在细胞分化成熟中的变化。 5.正常骨髓B细胞的分化和成熟 Ⅰ期:CD19、CD34、HLA-DR、TdT、CD10、Ig基因重排 Ⅱ期:失掉CD34、核TdT,CD10减弱,HLA-DR强度增加4倍, 同时表达HLA-DP和CD45 、CD19 Ⅲ期:CD20、HLA-DQ、SigM、CD19 Ⅳ期:CD19、CD21、CD22,不表达CD10 6.正常骨髓浆细胞的特点 两群:一群体积较小,表达CD22、CD35和SigE,是早期浆细胞。 另一群体积较大,膜抗原表达有明显异质性。 7.正常骨髓细胞DNA含量与细胞表型 S期:红系>粒系>单核系>淋巴系 淋巴系统中,S期的T细胞百分率明显低于B细胞
二、 流式细胞术在血液病学中应用
(一)白血病的分类研究 B-cell ALL 1.TdT positive. 2.CD10 positive, except for progenitor B-cell ALL. 3.HLA-DR positive. 4.CD19 frequently present without CD20. 5.Positive cytoplasmic μ chain in pre-B-cell type only. 6.Monoclonal surface immunoglobulin in L3 only. 7.Immunoglobulin gene or T-cell receptor gene rearrangement.
T-cell ALL 1.Positive TdT. 2.Usually negative CD10 and HLA-DR (more frequently positive in adult T-ALL). 3.CD7 is frequently the only positive T-cell marker, but all T-cell markers can be present. 4.T-cell receptor gene rearrangement.
Acute Myeloblastic Leukemia without Maturation (M1) 1.Greater than 90% of myeloblasts in the bone marrow. 2.Greater than 3% MPO-positive blasts in the bone marrow. 3.Blasts positive for CAE. 4.Blasts positive for CD33/CD13, HLA-DR. 5.Blasts negative for CD14, CD15,CD41/CD61,glycophorin. 6.Immunoglobulin and/or TCR gene arranged in mixed-lineage leukemia. 7.Specific cytogenetic abnormalities: t(9;22)(q34;q11) and inv(3) (q21;q26).
Acute Myeloblastic Leukemia with Maturation (M2) 1.30-90% of myeloblasts present in bone marrow. 2.Less than 20% monocytic precursors in the bone marrow 3.Less than 5×10 9 /L monocytic precursors in the peripheral blood. 4.Cytochemical stain for blasts: Positive for myelo-peroxidase and chloroacetate esterase but negative for α-naphthyl butyrate esterase. 5.Monoclonal antibody panel:Positive for CD13,CD15,CD33,HLA-DR,but negative for CD14. 6.Specific cytogenetic abnormality: t(8;21)(q22;q22).
Acute Promyelocytic Leukemia (M3) 1.Presence of more than 30% hypergranular (or hypogranular) promyelocytes in the bone marrow. 2.Presence of multiple Auer rods in the cytoplasm of leukemia. 3.Cytochemical staining: Strongly positive for myeloperoxidase and chloroacetate esterase, but negative for a-naphthyl butyrate esterase. 4.Immunophenotypeing : Positive for myelomonocytic antigens (CD13,CD15,CD33),negative for monocytic antigen (CD14) and HLA-DR. 5.Abnormal karyotype : t(15;17) detected by cytogenetic or molecular biological techniques. 6.Coagulation work up: Decreased platelets and fibrinogen; prolonged prothrombin, activated partial thromboplastin and thrombin times, and increased levels of fibrin degradation products.
Acut Myelomonocytic Leukemia(M4) 1.Presence of at least 30% myeloblast-monboblasts in bone marrow. 2.Monocytic component : More than 20% but less than 80% in bone marrow. 3.If monocytic component is less than 20% in the bone marrow. A.Monocyte count in peripheral blood should be greater than 5×10 9 /L. B.Serum lysozyme concentration should exceed three times the normal value.
4.Myeloblasts :More than 20% in bone marrow. 5.Myeloperoxidase positive cells : More than 3%. 6.Chloroacetate esterase and a-naphthyl butyrate esterase-positive cells: Roughly more than 20% each. 7.Abnormal chromosome 16 in M4 : Associated with M4 EO subtype. 8.Immunophenotype : Positive for CD13,CD14,CD15,CD33,and HLA-DR ,negative for CD41/CD42/CD61 and glycophorin A.
Acute Monoblastic Leukemia (M5) 1.Presence of more than 80% monocytic component among the nonerythroid cells in the bone marrow. A.M5a: 80% or more of monocytic components are monoblasts. B.M5b: Predominantly monocytes and promonocytes. 2.Elevation of serum and urine lysozyme levels. 3.Cytochemistry: Myeloperoxidase : may or may not be positive. Nonspercific esterase : strongly positive . Specific esterase and periodic acid-Schiff: usually negative . 4. Immunophenotype : Positive for CD11c,CD13,CD14,CD15,CD33,HLA-DR,negative for CD41, CD42, CD61 and glycophorin. 5. Cytogenetics : Association with t/del(11)(q23).
Acute Megakaryoblastic Leukemia (M6) 1.Presence of at least 50% erythroblasts among all nucleated cells in the bone marrow. 2.Presence of at least 30% myeloblasts among all nonerythroid cells in the bone marrow. 3.PAS positivity in all mature and immature nucleated erythroid cells. 4.Glycophorin-A antibody or other erythroid antibodies: The only reliable antibody for phenotyping. 5.React variably to myelomonocytic (CD13,CD33) and platelet (CD41) antibodies. 6.Most frequent cytogenetic abnormalities: -5/5q- ,-7/7q- .
Acute Megakaryoblastic Leukemia (M7) 1.Presence of 30% or more megakaryoblasts in the bone marrow. 2.Excess of blasts with increased numbers of maturing megakaryocytes in bone marrow biopsy , plus identification of megakaryoblasts in the peripheral blood and bone marrow aspirate by immunologic techniques. 3.Electron microscopic identification of platelet peroxidase in leukemic cells. 4.Monoclonal antibodies : CD41,CD42,and CD61 are specific for megakaryoblastic. 5.Myelomonocytic markers : Positive for CD33 but negative for CD13,CD14 and CD15. 6.PAS Staining pattern in megakaryocyte-megakaryoblasts : Periphery of cytoplasm and concentrated on cytoplasmic blebs. 7.t(1;22)(p13;q13): Specific for M7 infants.
(二)白血病细胞动力学 1、不同类型急性白血病细胞动力学差异不大。 2、RNA含量与细胞增殖活性呈正相关,G1期细胞DNA含量高于G0期。RNA高的细胞具有较高的增殖能力。 3、治疗前RNA高的急性白血病,化疗效果好,缓解期较长;RNA含量越低,则更多的细胞处于G0期,化疗效果差,不易缓解。一旦获得缓解,缓解期相当长。 4、DNA非整倍体是恶性细胞的标志,但急性白血病的DNA非整倍体检出率低于实体肿瘤。(三)预测化疗效果和微小残留病变(MRD) 1、小剂量阿糖胞苷(Ara-C)由于阻断DNA的合成而使S期增高; 2、小剂量阿糖胞苷(Ara-C)由于杀死S期细胞而使S期减少; 3、应用FCM动态观察化疗前后细胞动力学参数的变化,发现化疗有效者,化疗后S期和RNA 指数下降比无效者明显,且S期恢复较快。 4、MRD是白血病复发的根源。 (1)DNA非整倍体监测化疗效果;探测1%-3%残留白血病细胞;有DNA非整倍体的缓解期白血病多在三个月内复发。 (2)检测白血病相关抗原 CALLA+/TdT+ 抗原监测急淋或TdT+/CD5+抗原监测T细胞急淋。 (3)运用FCM分选感兴趣细胞分子水平的研究,如PCR、FISH等。(四)其他恶性血液病的应用 1.骨髓增生异常综合征(MDS) (1)依细胞动力学特点可分为RA、RARS、RAEB、CMML。 (2)低S期者预示生存期短。 (3)DNA非整倍体可作为MDS转化为白血病的早期指标。 2.慢性淋巴细胞白血病(CLL) (1)表面Ig荧光强度弱是CLL的特点,借此区别慢性淋巴细胞性淋巴瘤和幼稚淋巴细胞性白血病。 (2)慢淋的细胞动力学特点是骨髓和外周血的S期低(0.2),而淋巴结的S期却高达60%。其RNA含量低于正常淋巴细胞,通常难以发现DNA非整倍体。 3.慢性粒细胞白血病(CML) (1)CML是一种累及多种细胞系的白血病。 (2)90%以上CML Ph+,借此可探测MRD。 (3)CML急变时,可发现DNA非整倍体,急粒变时RNA升高,急淋变时RNA 下降。 (4)CML细胞动力学与正常造血细胞没有明显差异。 4.淋巴瘤 (1)大多数低危淋巴瘤的DNA多为二倍体或近二倍体。 (2)滤泡性淋巴瘤为近二倍体或近四倍体。 (3)弥漫性大细胞淋巴瘤多为高二倍体,Burkitt淋巴瘤为二倍体或高二倍体。 (4)滤泡性淋巴瘤主要表达B细胞标志,但不表达CD5,可区分滤泡性淋巴瘤白血病和CLL,区别Burkitt淋巴瘤(SIgG+,CD10-)和小细胞无核裂淋巴瘤(SIgG+,CD10+)。 (5)何杰金氏病多为二倍体,增殖活性不高,10%病人可为四倍体或高四倍体,伴有较多R—S细胞(CD15+、CD30+)。 5.骨髓瘤 骨髓瘤是干细胞疾病,其DNA非整倍体探测率高于其他恶性血液病(60%-80%),增殖活性低,RNA含量高,这些参数在不同类型的骨髓瘤中有一定预后意义。(五) 分选造血细胞 分选细胞是FCM的又一重要功能,目前主要用于: (1)骨髓移植,清除自身骨髓中恶性细胞或异体骨髓中参与移植反应的细胞。 (2)分选造血干细胞。 (3)进行分子生物学研究。
三.FCM在白血病基因产物的表达和细胞凋亡的检测
1.P53基因 P53是一种抑癌基因产物,此基因突变是包括白血病在内的恶性肿瘤常见的遗传学变化。2.P21ras原癌基因 其编码蛋白均为P21,对细胞分化生长起重要作用,其活化也是肿瘤发生的主要原因之一。3.Bcl-2抗凋亡基因 Bcl-2高度表达不仅可抑制白血病细胞凋亡,使其长期存活,而且对治疗反应差。4.凋亡 (apoptosis) 凋亡也称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)是细胞自我死亡的一种形式,是基因导向的细胞自我破坏的过程,通过细胞内核酸内切酶使核小体间DNA裂解,细胞死亡巨噬细胞清除。5.P170多药耐药基因 其mdr-1编码P170蛋白是细胞膜泵,将进入细胞内的化疗药物主动泵出细胞,使细胞内药物和浓度降低,白血病细胞表达P170,则诱导缓解率减低,复发率高和持续缓解时间短。6.谷胱甘肽转移酶(GST) GST主要涉及细胞解毒包括对某些化疗药物的分解,使进入细胞内的药物浓度降低。 FCM具有多参数检测的优点,一次可检测细胞周期分布、DNA倍体,P53、P21、bcl-1、P170、GST、凋亡等,并可研究参数间相互关系。随着特异单克隆抗体的增多,FCM检测的项目也越来越多,其快速、简便、同一标本可检测多项等到特点使FCM 至今应用不衰。
四.FCM在器官和骨髓移植的应用
(一) 移植前 1.交叉配型 2.监测骨髓中的肿瘤细胞或造血干细胞(二) 移植后FCM可用于监测移植后血液或植物内免疫成分的变化,以预测移植后免疫排斥反应、细胞免疫抑制治疗效果和移植物存活情况。
五.FCM在免疫血液病中的应用 FCM在免疫血液病的应用主要有以下几方面: 1.定量测定结合在细胞膜上免疫球蛋白或补体,协助自身免疫性溶血性贫血的诊断。 2.探测少见的细胞群,如骨髓移植后所出现的嵌合体。 3.探测血小板和白细胞抗体,协助诊断血小板减少性紫癜和输血后免疫性血小板 减少。 4.检测细菌、病毒、寄生虫以及其所引起的免疫反应,协助感染性疾病的诊断和病原体确立。
FCM在血液学有广泛的应用前景,特别是随着免疫标记物的发展,FCM程序化和质量控制的采用,以及与分子生物学完美地结合,将会对血液学定量研究产生巨大推动力。
四川迈克医疗设备工程技术有限公司学术应用部
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流式细胞术在血液学中的应用
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