流式细胞术在血液学中的应用

一、流式细胞术在基础血液学中的应用
(一)血细胞的计数和分类研究    1.红细胞的计数、分类及其功能的研究   (1)循环的红细胞总量的测定:    生物素—逆转抗生物素蛋白—FITC系统的特异性和流式细胞  仪(FCM)的敏感性结合起来,建立了FCM测定人红细胞总量的方法,此方法具有标本用量少,无放射性的优点,适用于儿童和孕妇测定循环红细胞总量。   (2)网织红细胞总数:    外周血网织红细胞计数(百分数和绝对值)是一反映骨髓红系增生活性的常用指标。许多学者先后提出应用FCM和不同的RNA特异性荧光染料自动计数网织红细胞的方法,如派若宁Y、AO、溴化乙啶、thiazole  orange等。    目前最普遍应用的是  thiazoie orange  染色法,这种特异性RNA  的激发波(488nm)测量的特点,与人工计数法相比,它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值,而且还能获得网织红细胞成熟指数(RMI)。RMI是一个检测骨髓功能的独立实验室指标,它与网织红细胞内RNA含量成正比,RMI可成功地用于评价骨髓移植的效果。    目前,FCM检测网织红细胞主要用于      1)预测骨髓移植的效果;      2)解释各种红系增长低下性贫血的发病原因;      3)评价某些新的重组生物制剂的治疗效果。    2.白细胞计数、分类及其功能的研究   (1)白细胞计数和分类    FCM方法避免常规染色过程中,由于细胞漂洗和分类溶解所致的人工假象,提供了可靠的评价血液状态的第一手资料,并进一步筛选细胞亚群、测定其他参数。LDS-751、CD45、thiazole  orange   (2)中性粒细胞的功能    FCM可在单个细胞水平上定量测定中性粒细胞的功能变化,有助于了解白细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性疾病的作用和诊断意义。(3)血小板功能的研究:    FCM可检测血小板膜抗原,如CD41a、CD42b、CD36、CD62p、CD63等。应用流式细胞术检测这些单克隆抗体的变化可用于:    a、评价血小板功能状态;    b、探测循环血液中激活的血小板;    c、探测血小板自身抗体。    如对原发性血小板减少性紫癜、慢粒急变和再障病人的血小板自身抗体的检测中发现,病人均可探测到IgM型自身抗体,有的病人可同时伴有IgM或IgA自身抗体,后者血小板减少更明显。因此,IgG血小板免疫荧光检查是检测自身免疫反应的敏感和特异指标,它可直接测定自身免疫性血小板减少病人的血小板表面免疫球蛋白,进行血小板交叉配型,以此为有自身免疫反应的病人选择合适的供血者。(二)正常骨髓各系血细胞特点的研究    1.造血干细胞的特点:    FCM多参数分析可以探测常规形态检查方法不能确认的造血干细胞。    2.红细胞系统的特点:    FCM系统地观察了红系统表面特异性抗原(Hle-1、CD71和Glycophorin  A)核酸及红细胞体积的变化来研究红系在正常骨髓分化成熟的规律。Glycophorin  A常作为红细胞晚期的特征,出现在有核红细胞,此时可与体积相似的淋巴细胞进行鉴别,Glycophorin  A在成熟红细胞达到最大值,不再随红细胞的成熟而变化。CD71表达介于Hle-1和Glycophorin  A之间,在Glycophorin  A出现之前,达到最大值。Hle-1主要表达在最早期可鉴别的红细胞上,随着红细胞的成熟而逐渐减少,红系随着成熟细胞体积逐渐减少的物理特点,可由FCM的前向散射光来测得。另外,在CD71和Glycophorin  A成熟红细胞中,DNA含量逐渐减少,以至只含有RNA,失去CD71成为成熟红细胞。    3.粒细胞的特点   (1)区别正常粒细胞和白血病克隆;   (2)确定白血病是以粒系为主,还是以单核细胞为主;   (3)探测粒细胞白血病的异质性。    4.巨核细胞的特点    应用FCM同时观察巨核细胞的体积,内部结构,DNA含量以及膜表面抗原在细胞分化成熟中的变化。    5.正常骨髓B细胞的分化和成熟    Ⅰ期:CD19、CD34、HLA-DR、TdT、CD10、Ig基因重排    Ⅱ期:失掉CD34、核TdT,CD10减弱,HLA-DR强度增加4倍,                      同时表达HLA-DP和CD45  、CD19             Ⅲ期:CD20、HLA-DQ、SigM、CD19    Ⅳ期:CD19、CD21、CD22,不表达CD10    6.正常骨髓浆细胞的特点    两群:一群体积较小,表达CD22、CD35和SigE,是早期浆细胞。    另一群体积较大,膜抗原表达有明显异质性。    7.正常骨髓细胞DNA含量与细胞表型    S期:红系>粒系>单核系>淋巴系    淋巴系统中,S期的T细胞百分率明显低于B细胞
二、 流式细胞术在血液病学中应用
(一)白血病的分类研究    B-cell  ALL    1.TdT  positive.    2.CD10  positive,  except  for  progenitor  B-cell  ALL.    3.HLA-DR  positive.    4.CD19  frequently  present  without  CD20.    5.Positive  cytoplasmic  μ  chain  in  pre-B-cell  type  only.    6.Monoclonal  surface  immunoglobulin  in  L3  only.    7.Immunoglobulin  gene  or  T-cell  receptor  gene  rearrangement.
    T-cell  ALL    1.Positive  TdT.    2.Usually  negative  CD10  and  HLA-DR  (more  frequently  positive  in  adult  T-ALL).    3.CD7  is  frequently  the  only  positive  T-cell  marker,  but  all  T-cell  markers  can  be  present.    4.T-cell  receptor  gene  rearrangement.
    Acute  Myeloblastic  Leukemia  without  Maturation  (M1)    1.Greater  than  90%  of  myeloblasts  in  the  bone  marrow.    2.Greater  than  3%  MPO-positive  blasts  in  the  bone  marrow.    3.Blasts  positive  for  CAE.    4.Blasts  positive  for  CD33/CD13,  HLA-DR.    5.Blasts  negative  for  CD14,  CD15,CD41/CD61,glycophorin.    6.Immunoglobulin  and/or  TCR  gene  arranged  in  mixed-lineage  leukemia.    7.Specific  cytogenetic  abnormalities:  t(9;22)(q34;q11)  and  inv(3)  (q21;q26).
    Acute  Myeloblastic  Leukemia  with  Maturation  (M2)    1.30-90%  of  myeloblasts  present  in  bone  marrow.    2.Less  than  20%  monocytic  precursors  in  the  bone  marrow    3.Less  than  5×10  9  /L  monocytic  precursors  in  the  peripheral  blood.    4.Cytochemical  stain  for  blasts:  Positive  for  myelo-peroxidase  and  chloroacetate  esterase  but  negative  for  α-naphthyl  butyrate  esterase.    5.Monoclonal  antibody  panel:Positive  for  CD13,CD15,CD33,HLA-DR,but  negative  for  CD14.    6.Specific  cytogenetic  abnormality:  t(8;21)(q22;q22).
    Acute  Promyelocytic  Leukemia  (M3)    1.Presence  of  more  than  30%  hypergranular  (or  hypogranular)  promyelocytes  in  the  bone  marrow.    2.Presence  of  multiple  Auer  rods  in  the  cytoplasm  of  leukemia.    3.Cytochemical  staining:  Strongly  positive  for  myeloperoxidase  and  chloroacetate  esterase,  but  negative  for  a-naphthyl  butyrate  esterase.    4.Immunophenotypeing  :  Positive  for  myelomonocytic  antigens  (CD13,CD15,CD33),negative  for  monocytic  antigen  (CD14)  and  HLA-DR.    5.Abnormal  karyotype  :  t(15;17)  detected  by  cytogenetic  or  molecular  biological  techniques.    6.Coagulation  work  up:  Decreased  platelets  and  fibrinogen;  prolonged  prothrombin,  activated  partial  thromboplastin  and  thrombin  times,  and  increased  levels  of  fibrin  degradation  products.
    Acut  Myelomonocytic  Leukemia(M4)    1.Presence  of  at  least  30%  myeloblast-monboblasts  in  bone  marrow.    2.Monocytic  component  :  More  than  20%  but  less  than  80%  in  bone  marrow.    3.If  monocytic  component  is  less  than  20%  in  the  bone  marrow.      A.Monocyte  count  in  peripheral  blood  should  be  greater  than  5×10  9  /L.       B.Serum  lysozyme  concentration  should  exceed  three  times  the  normal  value.
    4.Myeloblasts  :More  than  20%  in  bone  marrow.    5.Myeloperoxidase  positive  cells  :  More  than  3%.    6.Chloroacetate  esterase  and  a-naphthyl  butyrate  esterase-positive  cells:  Roughly  more  than  20%  each.    7.Abnormal  chromosome  16  in  M4  :  Associated  with  M4  EO  subtype.    8.Immunophenotype  :  Positive  for  CD13,CD14,CD15,CD33,and  HLA-DR  ,negative  for  CD41/CD42/CD61  and  glycophorin  A.
    Acute  Monoblastic  Leukemia  (M5)    1.Presence  of  more  than  80%  monocytic  component  among  the  nonerythroid  cells  in  the  bone  marrow.      A.M5a:  80%  or  more  of  monocytic  components  are  monoblasts.      B.M5b:  Predominantly  monocytes  and  promonocytes.    2.Elevation  of  serum  and  urine  lysozyme  levels.    3.Cytochemistry:      Myeloperoxidase  :  may  or  may  not  be  positive.      Nonspercific  esterase  :  strongly  positive  .      Specific  esterase  and  periodic  acid-Schiff:  usually  negative  .    4. Immunophenotype  :  Positive  for  CD11c,CD13,CD14,CD15,CD33,HLA-DR,negative  for  CD41,  CD42,  CD61    and    glycophorin.    5. Cytogenetics  :  Association  with  t/del(11)(q23).
    Acute  Megakaryoblastic  Leukemia  (M6)    1.Presence  of  at  least  50%  erythroblasts  among  all  nucleated  cells  in  the  bone  marrow.    2.Presence  of  at  least  30%  myeloblasts  among  all  nonerythroid  cells  in  the  bone  marrow.    3.PAS  positivity  in  all  mature  and  immature  nucleated  erythroid  cells.    4.Glycophorin-A  antibody  or  other  erythroid  antibodies:  The  only  reliable  antibody  for  phenotyping.    5.React  variably  to  myelomonocytic  (CD13,CD33)  and  platelet  (CD41)  antibodies.    6.Most  frequent  cytogenetic  abnormalities:  -5/5q-  ,-7/7q-  .
    Acute  Megakaryoblastic  Leukemia  (M7)    1.Presence  of  30%  or  more  megakaryoblasts  in  the  bone  marrow.    2.Excess  of  blasts  with  increased  numbers  of  maturing  megakaryocytes  in  bone  marrow  biopsy  ,  plus  identification  of  megakaryoblasts  in  the  peripheral  blood  and  bone  marrow  aspirate  by  immunologic  techniques.    3.Electron  microscopic  identification  of  platelet  peroxidase  in  leukemic  cells.    4.Monoclonal  antibodies  :  CD41,CD42,and  CD61  are  specific  for  megakaryoblastic.    5.Myelomonocytic  markers  :  Positive  for  CD33  but  negative  for  CD13,CD14  and  CD15.    6.PAS  Staining  pattern  in  megakaryocyte-megakaryoblasts  :  Periphery  of  cytoplasm  and  concentrated  on  cytoplasmic  blebs.    7.t(1;22)(p13;q13):  Specific  for  M7  infants.
(二)白血病细胞动力学    1、不同类型急性白血病细胞动力学差异不大。    2、RNA含量与细胞增殖活性呈正相关,G1期细胞DNA含量高于G0期。RNA高的细胞具有较高的增殖能力。    3、治疗前RNA高的急性白血病,化疗效果好,缓解期较长;RNA含量越低,则更多的细胞处于G0期,化疗效果差,不易缓解。一旦获得缓解,缓解期相当长。    4、DNA非整倍体是恶性细胞的标志,但急性白血病的DNA非整倍体检出率低于实体肿瘤。(三)预测化疗效果和微小残留病变(MRD)    1、小剂量阿糖胞苷(Ara-C)由于阻断DNA的合成而使S期增高;    2、小剂量阿糖胞苷(Ara-C)由于杀死S期细胞而使S期减少;    3、应用FCM动态观察化疗前后细胞动力学参数的变化,发现化疗有效者,化疗后S期和RNA  指数下降比无效者明显,且S期恢复较快。    4、MRD是白血病复发的根源。    (1)DNA非整倍体监测化疗效果;探测1%-3%残留白血病细胞;有DNA非整倍体的缓解期白血病多在三个月内复发。    (2)检测白血病相关抗原    CALLA+/TdT+  抗原监测急淋或TdT+/CD5+抗原监测T细胞急淋。    (3)运用FCM分选感兴趣细胞分子水平的研究,如PCR、FISH等。(四)其他恶性血液病的应用    1.骨髓增生异常综合征(MDS)    (1)依细胞动力学特点可分为RA、RARS、RAEB、CMML。    (2)低S期者预示生存期短。    (3)DNA非整倍体可作为MDS转化为白血病的早期指标。    2.慢性淋巴细胞白血病(CLL)    (1)表面Ig荧光强度弱是CLL的特点,借此区别慢性淋巴细胞性淋巴瘤和幼稚淋巴细胞性白血病。    (2)慢淋的细胞动力学特点是骨髓和外周血的S期低(0.2),而淋巴结的S期却高达60%。其RNA含量低于正常淋巴细胞,通常难以发现DNA非整倍体。  3.慢性粒细胞白血病(CML)   (1)CML是一种累及多种细胞系的白血病。    (2)90%以上CML  Ph+,借此可探测MRD。    (3)CML急变时,可发现DNA非整倍体,急粒变时RNA升高,急淋变时RNA  下降。    (4)CML细胞动力学与正常造血细胞没有明显差异。    4.淋巴瘤    (1)大多数低危淋巴瘤的DNA多为二倍体或近二倍体。    (2)滤泡性淋巴瘤为近二倍体或近四倍体。    (3)弥漫性大细胞淋巴瘤多为高二倍体,Burkitt淋巴瘤为二倍体或高二倍体。    (4)滤泡性淋巴瘤主要表达B细胞标志,但不表达CD5,可区分滤泡性淋巴瘤白血病和CLL,区别Burkitt淋巴瘤(SIgG+,CD10-)和小细胞无核裂淋巴瘤(SIgG+,CD10+)。    (5)何杰金氏病多为二倍体,增殖活性不高,10%病人可为四倍体或高四倍体,伴有较多R—S细胞(CD15+、CD30+)。    5.骨髓瘤    骨髓瘤是干细胞疾病,其DNA非整倍体探测率高于其他恶性血液病(60%-80%),增殖活性低,RNA含量高,这些参数在不同类型的骨髓瘤中有一定预后意义。(五) 分选造血细胞    分选细胞是FCM的又一重要功能,目前主要用于:    (1)骨髓移植,清除自身骨髓中恶性细胞或异体骨髓中参与移植反应的细胞。    (2)分选造血干细胞。    (3)进行分子生物学研究。
三.FCM在白血病基因产物的表达和细胞凋亡的检测
1.P53基因    P53是一种抑癌基因产物,此基因突变是包括白血病在内的恶性肿瘤常见的遗传学变化。2.P21ras原癌基因    其编码蛋白均为P21,对细胞分化生长起重要作用,其活化也是肿瘤发生的主要原因之一。3.Bcl-2抗凋亡基因     Bcl-2高度表达不仅可抑制白血病细胞凋亡,使其长期存活,而且对治疗反应差。4.凋亡  (apoptosis)    凋亡也称细胞程序性死亡(programmed cell  death,PCD)是细胞自我死亡的一种形式,是基因导向的细胞自我破坏的过程,通过细胞内核酸内切酶使核小体间DNA裂解,细胞死亡巨噬细胞清除。5.P170多药耐药基因    其mdr-1编码P170蛋白是细胞膜泵,将进入细胞内的化疗药物主动泵出细胞,使细胞内药物和浓度降低,白血病细胞表达P170,则诱导缓解率减低,复发率高和持续缓解时间短。6.谷胱甘肽转移酶(GST)    GST主要涉及细胞解毒包括对某些化疗药物的分解,使进入细胞内的药物浓度降低。    FCM具有多参数检测的优点,一次可检测细胞周期分布、DNA倍体,P53、P21、bcl-1、P170、GST、凋亡等,并可研究参数间相互关系。随着特异单克隆抗体的增多,FCM检测的项目也越来越多,其快速、简便、同一标本可检测多项等到特点使FCM  至今应用不衰。
四.FCM在器官和骨髓移植的应用
(一) 移植前     1.交叉配型    2.监测骨髓中的肿瘤细胞或造血干细胞(二) 移植后FCM可用于监测移植后血液或植物内免疫成分的变化,以预测移植后免疫排斥反应、细胞免疫抑制治疗效果和移植物存活情况。
五.FCM在免疫血液病中的应用     FCM在免疫血液病的应用主要有以下几方面:    1.定量测定结合在细胞膜上免疫球蛋白或补体,协助自身免疫性溶血性贫血的诊断。    2.探测少见的细胞群,如骨髓移植后所出现的嵌合体。    3.探测血小板和白细胞抗体,协助诊断血小板减少性紫癜和输血后免疫性血小板 减少。    4.检测细菌、病毒、寄生虫以及其所引起的免疫反应,协助感染性疾病的诊断和病原体确立。
    FCM在血液学有广泛的应用前景,特别是随着免疫标记物的发展,FCM程序化和质量控制的采用,以及与分子生物学完美地结合,将会对血液学定量研究产生巨大推动力。
四川迈克医疗设备工程技术有限公司学术应用部
(责任编辑:labweb)

常见问题
  • 如何在体龙基因完成所需的检测项目 流程简述 :在线咨询 - 采样送检 - 付款检测 - 检测分析 - 报告结果
查看详情

相关内容

官方客服团队

为您解决烦忧 - 24小时在线 专业服务