网织红细胞是什么样的细胞？
网织红细胞（reticulocyte，Ret）也是红细胞，不过它是未完全成熟的红细胞，也被称为年轻的红细胞。网织红细胞是红细胞成熟过程中的一个阶段，是幼稚的红细胞在脱去细胞核后即将完全成熟的红细胞。红细胞在骨髓内生成，成熟后进入血液循环。骨髓中红细胞系统的增生发育过程是：多能干细胞→单能干细胞→原始红细胞→早幼红细胞→中幼红细胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞。正常人的成熟红细胞寿命大约为120天，因此每天都有红细胞死亡，而同样每天都有相当于人体红细胞总数量大约1/120的新生红细胞进入血液循环，形成动态平衡。血液循环中的网织红细胞成熟大约需要24~48小时。网织红细胞经煌焦油蓝活体染色后，在胞体内可见到蓝色点状或网状的结构，经实验证明为核糖核酸（RNA）。在形态学上网织红细胞被认为和嗜多色性红细胞（polychromatic，RBC），都属晚幼红细胞脱核后生成的同种新生红细胞，因染色处理方法不同而表现出不同的形态特点。
网织红细胞发现的时间大概是什么时候，又是怎样发现的？
大约在1865年，Wilhelm. H. Erb医师在贫血患者的血片上发现红细胞中的颗粒，并用苦味酸显示了它们，从而发现了这种红细胞中的特殊结构，并将其描述为红细胞从有核状态到成熟前的过渡期细胞。而后Erhich用亚甲蓝对血液进行活体染色，制成血片后在显微镜下发现了红细胞内的网状结构，将其称为网织红细胞，并建立了网织红细胞活体染色和显微镜检查法（图1-网织红细胞煌焦油蓝染色）。一个多世纪以来网织红细胞的测定在贫血的诊断、疗效估计、鉴别诊断等方面起到重要的作用。
目前测定网织红细胞的方法主要有哪些？相关性如何?
目前网织红细胞检测方法主要有传统的显微镜计数方法和具有网织红细胞分析功能的全自动血细胞分析仪上测定两大类。当然还可以用流式细胞分析仪进行测定，但往往不适宜临床实验室常规使用；还曾有过专门用于网织红细胞计数的专用仪器，但现在血细胞分析仪已经具有这项功能，所以专用网织红细胞分析仪器已经很少发展和很少用户在使用。
显微镜法网织红细胞计数方法如下：
试剂配制：10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液
煌焦油蓝 1.0 g
柠檬酸钠 0.4 g
氯化钠 0.85 g
蒸馏水 加至100ml（过滤后备用）
操作步骤：①取干净小试管一只，加入10g/L煌焦油蓝溶液2～3滴，然后加入等量的血液。混匀后放置15～20min，使红细胞充分染色。②取少许染色好的血液，在洁净载玻片上推成薄而均匀的血膜。③干燥后用瑞氏染液复染（也可不复染）。④在显微镜低倍镜下选择细胞分布均匀，着色清晰的部位，用油镜计数1000个红细胞内网织红细胞数再除1000计算出网织红细胞百分数。严重贫血病人，应计算网织红细胞的绝对值（网织红细胞百分数×每微升内的红细胞数）。
窥盘计数法：为准确计数，提供计数精密度，可使用米勒（Miller）窥盘辅助（米勒窥盘）。米勒窥盘是一种安装于显微镜目镜中的装置，其上具有大小两个方格，其面积之比为9：1。血片的染色和制片同于上述的方法，计数时将血片放置在显微镜上，使用窥盘上的小方格计数红细胞数量，大方格用于计数网织红细胞数量；当小方格内红细胞总数超过111个时，即表明计数红细胞总数已经超过1000个，此时将所计数到的网织红细胞总数累积，经过计算即可得到网织红细胞百分比。
仪器法和传统的显微镜法计数原理和做法各不相同，显微镜法是直接法，可以直接观察到网织红细胞。但是因为操作和计数过程完全依据人的能力而定，且计数的细胞数量有限，还有染色情况、染色比例、细胞分布情况、个人能力问题等诸多的不确定因素和不标准化问题，因此计数上的精密度和准确性受到一定的影响。但是这种方法在没有自动化设备的医院，在基层医院，在严格制定操作规范和对操作者严格培训的条件下，是可行的实验方法。而自动化仪器在许多方面具有标准化程序，试剂稳定、反应时间一致、计数细胞数量大（一般计数RBC数量在10000~50000）、具有质控和校准能力，因此在精密度和准确性上明显优于显微镜计数法。但是当仪器在出现报警信息、散点图异常等情况下，要认真分析原因，必要时需要通过显微镜法进行核实，才是比较稳妥的做法。我自己曾经遇到过一例非常高的网织红细胞计数结果，因为仪器测定得到的网织红细胞是43%，这样高的结果有些不敢相信，因此做了网织红细胞染色涂片镜检。结果所见到的网织红细胞数量确实非常高，验证了仪器分析所得到的结果。（图2-高网织红细胞显微镜图）
网织红细胞是一类细胞，还是可以分为几类呢？
传统方法是根据网织红细胞内网状结构进行分类的，红细胞中的网状结构越多越密集，表示该细胞越幼稚。Heilmyer根据其发育阶段将网织红细胞分为5型，用此表示造血功能的盛衰。O型：是有核网织红细胞，胞质内含有的网织物质仅见于正常骨髓中；Ⅰ型：红细胞几乎被网织物充满，又称为丝球型，也多在正常骨髓中出现；Ⅱ型：位于红细胞中央线团样结构开始松散，又称为网型，多存在于骨髓中；Ⅲ型：网状结构稀少，呈不规则枝点状排列，又称为破网型，正常人外周血中可见少量；Ⅳ型：胞质中嗜碱性物质很少，呈分散的细颗粒状或短丝状，又称为点粒型，外周血中见到的网织红细胞以此类型为多见。而国际血液学标准化委员会（ICSH）所制定的分类中，不包括Heilmyer分类法中的O型。网织红细胞Ⅰ~Ⅳ型见图3（图3-网织红细胞分型，瑞氏染液复染效果，罗马文字为标示的细胞分型）。
而现代血细胞分析仪上所进行的网织红细胞分析，也可将网织红细胞进行分类，但是它不同于形态学分类方法。它是依照网织红细胞被试剂中荧光染料染色后RNA物质发射出的荧光强度来进行划分的，高荧光强度网织红细胞（HFR）是比较幼稚的细胞、中荧光强度网织红细胞（MFR）是中等成熟度的细胞、低荧光强度网织红细胞（LFR）是比较接近成熟的网织红细胞。
目前市场上现有的网织红细胞自动计数和分析方法的特点？
目前应用较多的是带有网织红细胞分析功能的多参数血细胞分析仪，它们使用各种荧光染料和非荧光染料对网织红细胞进行染色，并依据自己的原理进行检测。这些具有网织细胞分析能力的全自动血细胞分析仪除了可以给出网织红细胞百分比外，还可给出网织红细胞计数绝对值、网织红细胞体积、网织红细胞内血红蛋白含量、网织红细胞成熟程度、网织红细胞分群等许多参数，这些参数是网织红细胞分析、临床应用和研究的热门领域。为保证网织红细胞计数的准确性和稳定性，这些仪器一般都有配套的商品化的网织红细胞质控品，并以高、中、低不同浓度的结果对仪器进行全面质量管理，而传统方法在实施网织红细胞质量控制方面显得无可作为。
网织红细胞分析仪器法除了给出相关的网织红细胞数据外，还可提供网织红细胞散点图（scattergram），这些不同的散点图一般会以平面图的方式表达，但实际上它们应该为三维格式的图形，在图中颜色密度大的位置一般表示检测到的数据信号多，如果用三维图来表示的，这里应该是细胞分布最集中或密度最大的区域（图4-血细胞三维图），例如红细胞分布群。五分类法血细胞分析仪所提供的散点图也都是散点图格式，在显示或打印时只能用两维图的方式进行输出。
目前国内应用的带有网织红细胞分析功能的多参数血细胞分析仪主要为进口产品，主要品牌有贝克曼-库尔特（Beckman-Coulter）、日本希森美康（Sysmex）、雅培（Abbott）、西门子（Seimens）、Horiba（ABX）公司等厂家。国内已有迈瑞公司等血液分析仪生产厂商涉及此方面的研发，相信不久将来会有国产仪器问世。由于这些自动化仪器的使用，网织红细胞计数的精密度更有明显提高。统计表明对低网织红细胞标本，仪器法CV在10%~20%之间；对正常范围的标本，CV值在3%~16%之间；高值标本，CV更可降低到2%~10%。
Sysmex公司产品
二十世纪90年代日本Sysmex公司开发了全自动血液细胞分析仪SE-9000，它可在主机上附加一个半自动式的网织红细胞分析组件，形成SE-9000/RAM-1，是一种具有网织红细胞分析能力的五分类血液细胞分析系统。而且该公司还增加开发过单独完成网织红细胞分析的R系列仪器。而Sysmex XE-2100和XT-2000i等五分类血细胞分析仪器在检测网织红细胞时，可以实现不同标本随机选择检测CBC、DIFF、RET的模式，加快了测定速度和应用的便捷性。这类仪器用聚次甲基荧光染料对网织红细胞进行染色，其特征是染料中含有和次甲基相连的杂环核，当染料结合了膜或核酸后，其分子运动受到干涉，所以会吸收更多的光并发出更强的荧光。此外仪器除了进行全自动的网织红细胞绝对值和百分比计数外，还可以通过对网织红细胞核酸染色得到的荧光信号强度区分出低、中、高荧光强度的网织红细胞（LFR、MFR、HFR）（图6-XE2100网织红细胞散点图）。由于幼稚的网织红荧光信号较强，MFR和HFR之和即成为反映未成熟网织红的一个有用参数－未成熟网织红细胞比率（Immature Reticulacyte Fraction，IRF)，该参数1997年被美国FDA批准成为可以作为临床应用的报告参数。
网织红细胞检测试剂分为RET-SEARCH II DILUENT稀释液和RET-SEARCH II DYE染色剂。网织红细胞首先经过稀释液处理，使红细胞和白细胞肿胀并且轻微损伤细胞膜以便染料容易进入细胞内，然后染色剂中的聚次甲基染料进入细胞内，使网织红细胞中的RNA和白细胞核内的DNA染色着色。由于RNA含量的不同，所以可以将红细胞和网织红细胞区分出来；由于DNA和RNA含量的不同，可以将网织红细胞从白细胞群体中区分出来。
仪器分析网织红细胞时，其成熟度分群是怎样定义的？
仪器所进行的网织红细胞成熟度分群不同于显微镜法所进行的分型，它可以对网织红细胞成熟程度进行分群，可以获得各群细胞的百分比和绝对数量。网织红细胞内RNA含量多少与其成熟程度有关，这些不同RNA含量的网织红细胞被相应的荧光或非荧光染料染色后，根据激光照射后发射特定颜色荧光的强弱程度、或光吸收量大小、光散射量多少等参数的比例关系进行分析。例如高荧光强度网织红细胞（HFR)、中荧光强度网织红细胞（MFR）、低荧光强度网织红细胞(LFR)。例如Sysmex XE-2100仪器的HFR表示网织红细胞中含有较多的RNA物质，其荧光染料结合能力较强，荧光发射量强，检测到此类细胞，表示是较为幼稚的网织红细胞，而LFR是较为成熟的网织红细胞（图10-网织红细胞荧光含量图示）。目前各种具有网织红细胞分析能力的血细胞分析仪，无论在是半自动还是全自动仪器，甚至使用流式细胞分析仪都可以或具有对网织红细胞的分群能力，虽然其名称不一致，但是所包含的内容基本相同。有文献报道正常人这三种荧光强度的网织红细胞分群所占比例大致为LFR：77％～94％；MFR：5％～18％；HFR：0～5％。
但是这种分群的概念和显微镜下依据形态学特点而进行的网织红细胞分型还是不同的，还不能将其一一对应。
现在临床上网织红细胞的参考范围是多少？
成人：0.8%~2.0%，绝对值(25~75)×109/L
新生儿：2.0%~6.0%
网织红细胞的测定或计数，现在还有哪些新的参数应用于临床？
这些参数有的可以通过人工计数和计算获得，有的需要通过专用仪器分析计算获得。
1 网织红细胞生成指数（reticulocyte production index，RPI）：一般网织红细胞在血液中的生存期为1天，若红细胞生成加速，释放入血速度增加，此时网织红细胞在血液中的生存期会延长至2～2.5天，意味着网织细胞数量的增高将导致对红细胞生成速率的过高估计。而RPI可以很好的纠正这种网织红细胞提前释放引起的计算误差，在估计红细胞生成有效性方面更加确切和准确，因而在贫血起因的分类方法中起到重要作用。
2 网织红细胞成熟指数（RMI）：该参数是计算参数，可由仪器自动计算，也可将仪器测定的网织红细胞分群参数经过人工计算得到。计算公式为：RMI＝（MFR+HFR）/LFR×100%。文献报道RMI的参考范围，男：17％～37％，女：16％～35％；用COULTER LH755测定的结果为14%～38％。
3 平均网织红细胞体积(MRV)：为测量结果，因网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其体积往往大于正常红细胞。文献报道其参考范围，男：89.9～123.9fl；女：93.8～122.8fl；而应用COULTER LH755测定的一组正常人参考范围是93.8～121.5fl。
4 网织红细胞血红蛋白含量(CHr)：是BAYER ADVIA 120血液分析特有的测定参数之一，目前是被认为具有许多诊断和疗效观察价值的新的网织红细胞测定参数。因为是未成熟的红细胞，其细胞内的血红蛋白含量会低于成熟红细胞。正常人CHr>28.0pg/L。
5 网织红细胞的成熟度（IRF）：IRF为不成熟的网织红细胞数与总网织红细胞数的比值，IRF越大表示不成熟的网织红细胞的数量越多。正常人平均值为0.22，参考范围0.1～0.38；贫血患者均值为0.38，范围在0.16～0.6。
6 其他参数：Siemens Advia 120型血细胞分析仪在网织红细胞测定上有强大的功能，有更多的网织红细胞特性参数。除了已经列为常规报告参数的网织红细胞百分比和绝对值外，网织红细胞平均血红蛋白含量(CHr)也已经被FDA认可作为临床报告参数。此外供实验室内部或供研究使用的还有：成熟红细胞平均体积（MCVm）、网织红细胞平均体积（MCVr）、平均网织红细胞血红蛋白浓度(CHCMr)、网织红细胞体积分布宽度(RDWr)、网织红细胞血红蛋白量分布宽度(HDWr)、高中低荧光强度网织红细胞百分比和绝对值以及相关的直方图（图11）和散点图。而PENTRA 120型则具有分析网织红细胞平均荧光指数(MFI)的能力。
网织红细胞测定的临床意义有哪些？
因为使用了仪器分析法，网织红细胞已经不仅仅是一个计数参数的问题，更有许多新的参数被引入临床应用、科研和基础研究。网织红细胞的增加或减少直接反映了骨髓红细胞的生成能力，主要用于对红细胞减少性疾病、溶血性贫血、治疗监测或骨髓移植后骨髓造血功能的恢复、监测放疗和化疗对骨髓造血功能的影响评估等方面。
1 网织红细胞计数和绝对值的临床意义
(1) 网织红细胞增加是对贫血的反应。网织红细胞数量超过参考范围可被看成是骨髓造血功能对贫血的正常反应。贫血的恢复是通过骨髓释放红细胞生成素（EPO）完成的，通过网织红细胞计数可以敏感的反映出贫血原因是由于RBC生成减少还是失血造成。网织红细胞数量升高，还应同时关注胆红素增高程度、红细胞破坏和血红蛋白丢失量等方面的实验结果。如溶血性贫血，大量网织红细胞因骨髓受到缺氧和大量红细胞破坏后产物的刺激而增加，并提前进入外周血，增加程度常在5％以上，严重时可达20％以上；急性失血后网织红细胞可明显增加，急性失血5～10天内网织红细胞可达高峰，出血停止后2周可恢复正常，临床上可用此参数和特点来判别出血是否停止。其他因素导致的贫血，如缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、放化疗后恢复期、无效造血但红系增生活跃等情况也可见网织红细胞轻度增加。
(2) 网织红细胞降低。主要和正常造血功能减低有关，典型病例为再生障碍性贫血（再障）、溶血性贫血再生障碍危象；此外还有急性白血病、类风湿关节炎、老年患者、慢性病、获得性红系再障、化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制或减退等。
2 CHr测定的意义
很多研究表明，CHr诊断铁缺乏时，敏感性和特异性可达到100%和80%；CHr与HCT诊断溶血者铁缺乏时也具有较高的敏感性和特异性；CHr与HFR可以反映溶血者体内铁的供应情况；CHr、MCVr、CHCMr等参数可反映铁缺乏患者铁剂治疗效果。近10余年来，CHr在诊断和治疗监测方面的应用已经成为热点。
（1）CHr在诊断缺铁性贫血方面的应用价值。由于网织红细胞在体内存活仅仅1～2天，所以可以直接透视出变化中的红细胞铁的状态，也提供了人体含铁的信息，只有当红细胞膜或胞质改变时CHr才会改变。目前的缺铁性贫血的诊断标准是CHr≤28pg和低色素性红细胞（HYPO）≥5%，ROC曲线也显示出在缺铁性贫血诊断指标中CHr比MCV和血清铁敏感性和特异性更佳。
（2）CHr与地中海贫血基因间的关系。 Christophille等研究了57名铁充足条件下的杂合型的β地中海贫血患者，依据基因型分为3组：βsilent、β+、β-型。发现在CHr和HbA2之间有明显的负相关（r=-0.790，P<0.00001）。这项研究首次阐明了CHr为评价杂合型的β地中海贫血不同基因型提供了便利。 3 网织红细胞生成指数（RPI）的应用 Kinetic等应用RPI可以较为准确地表达出网织红细胞的成熟状态，从而对贫血的类型进行划分，如正常人平均RPI为1，当RPI≥3时表示红细胞生成增加，如溶血性贫血和治疗后的营养性贫血；而RPI≤2时为红细胞生成减少，如缺铁性贫血；而EPO缺乏(如肾病)、再生障碍(如再生障碍性贫血)、浸润性疾病(如白血病)、无效造血(如巨幼细胞性贫血)等情况时，RPI多处于2～3这一区间，Kinetic法则还无法确定 4 网织红细胞成熟度（IRF）的应用 ①监控在化疗、骨髓移植、红细胞生成素干细胞移植后红细胞生成素的再生状况；②监测叠氮胸苷（azidothymidine）治疗后药物给骨髓造成的毒性损害；③监测肾衰竭、AIDS、婴儿脊髓发育不良综合征；④贫血的分类；⑤监测铁剂、Vit B12、叶酸等对贫血的治疗功效。 5 网织红细胞分群的意义 LFR和HFR可作为某些贫血病的初筛指标。例如溶血性贫血时Ret、LFR和HFR可明显升高，而肾性贫血患者LFR下降、HFR升高、Ret变化不大。 （1）用于促红细胞生成素贫血治疗。 Chiao-Lin Chuang等学者观察研究了在给对溶血性贫血患者重组人红细胞生成素（rHuEPO）治疗过程中，给予适量铁剂补充时，传统的红细胞参数、铁代谢参数和网织红细胞、CHr和HFR的变化情况。研究发现无论在实验第２周还是第4周，CHr 和HFR的变化都要比传统的红细胞和铁代谢参数更为显著，可作为诊断缺铁性红细胞的可靠参数，也可以对溶血患者在利用rHuEPO治疗过程中的反应进行监测。 （2）监测急性髓性白血病的治疗和观察骨髓移植后造血恢复情况。研究表明红系增生是粒系多核细胞恢复的早期和敏感指标，首先出现增加的是网织红细胞内MFR群，而后是HFR群，其变化的顺序基本是MFR+HFR，多核细胞、Ret绝对值。骨髓移植后8～9天，HFR增高是最早出现的骨髓造血功能恢复的敏感指标，其后是网织红细胞上升（约20天）、分叶核粒细胞上升（约46天）。HFR+MFR的变化已经被许多研究认可，可以作为评价肿瘤患者化疗期间监测骨髓造血功能受抑制和开始恢复的较敏感指标。 （3）网织细胞分群和贫血诊断和治疗监测。在20世纪90年代初就有不少研究试图以分群的变化来区分各类贫血，而后CHUNG-CHE等又分析IRF和RPI与网织红细胞绝对值间的相关关系，但都没有成为贫血确诊的依据。也有研究表明，溶血性贫血（HA）患者由于骨髓造血功能活跃，大量新生的网织红细胞释放到外周血，导致外周血Ret及HFR显著增高。白血病化疗期间患者骨髓造血功能受抑，外周血中的Ret极度减低，HFR中度减低。缺铁性贫血（IDA）患者铁剂治疗前，Ret无明显改变、HFR轻度增高，铁剂治疗1周后，Ret及HFR可呈中度增高，因此两个参数可作为IDA患者铁剂治疗后的疗效观察指标。再生障碍性贫血（AA）患者外周血Ret中度减低，而HFR中度增高，这种现象可能反应了AA 患者造血功能紊乱时的红细胞生成变化。另外在鉴别诊断MDS方面，Lesesve对比了70名MDS患者和220例正常人后发现HFR、RMI和IRF的P<0.01，说明MDS患者产生的大量生存期延长的“幼稚”的网织红细胞是导致HFR增加的原因。 总之，网织红细胞分析具有很广泛的应用前景，新技术和新参数的应用会给临床诊断、治疗和监测带来新的研究方向和发展。 现有血液分析仪测定网织红细胞的不足之处还有哪些？未来的发展方向主要是什么？ 现有的高端血细胞分析仪所具有的网织红细胞分析能力目前可以满足临床常规测定要求，但是价格比较偏高，试剂成本和质控成本略高，可能影响到一部分用户的使用期望。是否可以研制开发小型的，适合基层医院常规使用的网织红细胞计数分析设备，或者在小型血细胞分析仪器上配置该功能，使得在网织红细胞分析需求量相对较少的医疗实验室使用。有重点的结合临床需求，设计新的分析参数，以利于临床在相关贫血性疾病、血液病、肾脏疾病、免疫性疾病、移植、临床治疗等方面新的测定或计算参数的开发。还应继续加强网织红细胞计数和新参数的临床应用研究、基础理论研究等工作。在网织红细胞在正常人群中、不同性别、不同年龄组之间的参考范围的建立；各个新参数参考范围的确立；各种不同型号网织细胞分析仪器结果的比对；网织红细胞仪器法测定实验室质量评价等方面还有很多细致的工作要做。希望有条件的单位或实验室开展相关工作，将网织红细胞的分析质量、能力和应用提高一步。 （责任编辑：lgh）
