骨髓细胞染色体畸变试验

1　主题内容与适用范围　　本标准规定动物骨髓染色体畸变试验的基本技术要求。　　本标准适用于检测环境有害物质对大、小鼠骨髓细胞的遗传毒性。　　2　原理　　染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大、小白鼠腹腔注入秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散，轮廓清晰。在显微镜下观察染色体数目和形态。　　3　试剂　　全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸馏水。　　3.1　0.1%秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存。　　3.2　2.2%柠檬酸钠。　　3.3　pH7.4磷酸缓冲液。　　3.3.1　1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.47g溶于1000mL蒸馏水中。　　3.3.2　1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4)49.07g溶于1000mL蒸馏水中。　　3.3.3　将磷酸氢二钠溶液80mL与磷酸二氢钾溶液20mL混合，用pH计测定并调节pH至7.4。　　3.4　0.075mol/L氯化钾溶液。　　3.5　甲醇(分析纯)：冰乙酸(分析纯)以3∶1混合，临用现配。　　3.6　Giemsa溶液。　　3.6.1　Giemsa储备液：取吉姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨，逐渐加甲醇至375mL，溶解后再加125mL纯甘油，于37℃温箱保温48h，在此期间摇动数次，放置1～2周过滤备用。　　3.6.2　Giemsa应用液：取1mL储备液加入10mL pH7.4磷酸缓冲液。　　4　仪器与设备　　4.1　实验室常用设备。　　4.2　恒温水浴锅37±5℃。　　4.3　离心机。　　4.4　生物显微镜。　　5　操作步骤　　5.1　动物处理　　5.1.1　取健康成年大、小鼠。　　5.1.2　按LD50的1/4、1/8、1/16，也可用最大耐受剂量为最高剂量，下设三个剂量，经口给予受试物2～4次，每次间隔24h，在末次给受试物后18～24h取材。另设阴性对照组(溶剂对照)及阳性对照组。每组两个性别的动物数各不少于5只。必要时可先用一个剂量的3只动物，于给受试物后6，24，48h分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用15只动物，于6，24，48h后分别各处死5只动物取材。　　5.2　取材　　5.2.1　处死动物前2～4h，按4mg/kg体重腹腔注入秋水仙素。　　5.2.2　大鼠断头处死、小鼠颈椎脱臼。　　5.2.3　取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨骺，用带针头的注射器吸取2～4mL2.2%柠檬酸钠溶液，将骨髓洗入10mL离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以1000～1500r/min离心10min，弃去上清液。　　5.3　低渗处理　　离心后的沉淀物加入4mL0.075mol/氯化钾溶液，混匀后在37℃水浴或恒温箱中放置10～20min，再以1000～1500r/min离心，弃去上清液。　　5.4　固定　　将新配制甲醇－冰乙酸固定液4mL沿管壁加入样品中，10～15min后，用吸管将细胞团块打碎继续固定10～15min，以1000r/min离心10min弃去上清液，再加固定液4mL静置20min后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成0.5～1.0mL细胞悬液。　　5.5　制片　　5.5.1　先将洗净的载玻片保存干冰水中备用。　　5.5.2　自冰水中取出载玻片，倾斜30°放置，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3处滴3滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个样品制2～3张玻片，空气中自然干燥。　　5.6　染片　　临用时取Giemsa储备液1mL加磷酸缓冲液10mL，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色15min左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。　　5.7　镜检　　5.7.1　在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。　　5.7.2　用油镜进行细胞中期染色体分析。　　5.8　观察项目和结果判定　　5.8.1　每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个中期相细胞。观察项目为染色体数目和结构改变，统计学处理用X2检验。　　5.8.2　染色体数目的改变　　5.8.2.1　非整倍体：亚二倍体或超二倍体。　　5.8.2.2　多倍体：染色体成倍增加。　　5.8.3　内复制：包膜内的特殊形式的多倍化现象。　　5.8.4　染色体结构的改变。　　5.8.4.1　断裂：损伤长度大于染色体的宽度。　　5.8.4.2　微小体；较断片小而呈圆形。　　5.8.4.3　有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。　　5.8.4.4　无着丝点环：成环状结构　　5.8.4.5　单体互换：形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。　　5.8.4.6　双微小体：成对的染色质小体。　　5.8.4.7　裂隙：损伤的长度小于染色单体的宽度。　　非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、粘着等。　　附加说明：　　本标准由卫生部卫生监督司提出。　　本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、哈尔滨医科大学、杭州市卫生防疫站负责起草。　　本标准主要起草人韩驰、唐玲光、袁振华。　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
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