一例无创产前检测胎儿染色体非整倍体假阴性病例

作者：王文芳1   韩燕媚1★作者单位： 1、 海口市妇幼保健院，海南，海口 570100★通讯作者：韩燕媚  摘要  本文通过对1例无创产前检测（non-invasive prenatal testing , NIPT ）结果为假阴性的病例进行分析，综合评价NIPT在临床应用中的局限性。对于NIPT提示低风险的孕妇，后期的B超随访至关重要。科研项目：海南省卫生厅科研项目（21A200074）    概述    传统的产前筛查是对孕妇进行血清学筛查，继而高风险的孕妇采取有创的产前诊断方法如绒毛取样、羊膜腔穿刺和脐静脉穿刺等，分析其染色体核型，再经过遗传咨询后对异常胎儿进行选择性引产。但有创产前诊断操作具有侵入性，有发生感染、出血甚至流产、死胎等的风险。随着高通量测序技术的发展，NIPT则以更安全、高效、准确的非侵入性检测在产前筛查中得到了广泛的应用，但是NSGC在2013年针对NIPT的遗传咨询发表了指导意见，指出NIPT当前只作为染色体非整倍体评估的补充检测，其结果不能视为诊断。有检测局限性，存在一定的漏诊风险。因此，我们对开展NIPT后发现的1例假阴性结果进行分析，总结临床应用中的局限性。    对象和方法    2.1对象  孕妇29岁，G1P0，于海口市妇幼保健医院进行常规产前检查。孕妇末次月经为2021年9月20日，自然受孕，早孕期NT1.8mm，孕17+周中期唐筛21三体临界风险，风险值（1:875），孕18 周于本院进行NIPT检测，结果提示13-三体、18-三体、21-三体低风险。停经23周B超检查显示孕20+周胎儿生长受限、双肾盂分离、胎儿左侧脉络丛囊肿。进行进一步的遗传咨询及产前诊断，于妊娠23周在本院行羊膜腔穿刺术，取羊水细胞行羊水细胞染色体核型分析及单核苷酸多态性微阵列（SNP array）检测。2.2 方法孕妇引产后留取胎盘及脐带，分别取胎盘的胎儿面中心、胎儿面边缘、胎盘母体面中心、胎盘母体面边缘及脐带组织，应用DA8600高通量测序仪对孕妇胎盘不同位置的组织及脐带组织进行染色体拷贝数变异检测。样本染色体变异程度统计方法如下：特定染色体的变异程度＝（染色体 reads 数）／（参考序列中染色体平均 reads 数）× 100％  结果孕妇引产后胎儿胎盘及脐带组织结果显示：高通量测序在胎盘的母体面中心为chr22: 22q11.1−q12.3(17,251,397-33,550,374)×３，胎盘母体面的边缘检测为未见明显异常，而胎盘胎儿面的边缘为 chr22: 22q11.1−q12.3（17,250,543-33,550,161）×３，胎盘胎儿面的中心为chr22: 22q11.1−q12.3（17,250,217-33,550,097）×３，脐带组织为chr22: 22q11.1−q12.3(17,250,391−33,549,998) ×3。表1显示如下：  表1 胎盘DNA测序结果备注：根据R值来判定结果是否有三体、单体或者嵌合   0-0.8嵌合三体，-0.8-0嵌合单体。  图1 胎儿染色体核型47，XN，+del（22）（q12）  讨论    NIPT具有高灵敏度、特异性和安全无创等优点，且对于21三体、18三体、13三体有较高的检出率，因此在产前检测中得到了广泛的应用。然而NIPT检测的胎儿细胞来源为胎盘滋养细胞   ［3］   ，仅能针对上述三种染色体的数目异常进行检测，不能排除胎儿染色体易位和倒位携带者、嵌合体、基因突变、环境因素所引起的智力障碍、畸形等疾患和非检测范围内的微缺失微重复等。  本例孕妇于妊娠 23周在本院行羊膜腔穿刺术，取羊水细胞行染色体核型分析及单核苷酸多态性微阵列（SNP array）检测均提示胎儿22号染色体部分三体。进一步的分析在胎盘的胎儿面及胎儿面中心及母体面中心处均检测到22部分三体，胎盘母体面边缘未检测到明显异常，与胎儿核型不一致。这例胎儿22部分三体的漏诊与NIPT 检测的原理有关。每条染色体在基因组中所占比例是一定的，若母体某条染色体reads 数比例超过临床阈值的上限或低于其下限，则提示胎儿存在某条染色体的重复或缺失。孕妇胎儿所携带的22部分三体并未影响22号染色体的比例，这可能是NIPT 检测漏诊的原因。后续的分析提示该病例存在22部分三体限制性胎盘嵌合体，然而在NIPT 检测中为阴性。这与NIPT 可检测限制性胎盘嵌合体的报道不一致［4-5］。NIPT技术所检测的胎儿DNA主要来源于胎盘，且有报道提示限制性胎盘嵌合体样本可呈现为NIPT检测阳性。然而对阳性结果与胎盘嵌合部位以及嵌合比例的相关性则鲜有研究。CPM根据异常细胞系在胎盘的分布不同进行分类，可分为三种类型：Ⅰ型异常 核型出现在细胞滋养层；Ⅱ型异常 核型出现在绒毛基质内；Ⅲ型异常 核型分布于细胞滋养层和绒毛基质内［6］。该病例在胎盘胎儿面中心及边缘，母面的中心检测到22三体的部分嵌合。也有专家认为母血NIPT检测的是胎盘绒毛滋养细胞的DNA，而取胎盘绒毛直接检测的话，通常国内的处理是不分离滋养细胞和间充质细胞的，那么这个胎盘样本就是包含两种细胞了，该病例假设滋养细胞是正常的，间充质细胞是22异常，而间充质细胞是更能代表胎儿的。所以这种假设也推测该病例为限制性胎盘嵌合III型。尽管NIPT已经被用于非整倍体筛查且具有较高的灵敏度和特异性，但其仍不能完全取代侵入性的产前诊断。结论综上所述，造成本文该例NIPT 假阴性的原因可能与目前NIPT检测原理的局限性有关，检测结果存在假阳性及假阴性等问题。易位型三体、局限性胎盘嵌合体和染色体微缺失均可能造成胎儿异常染色体的游离DNA比例无法达到临床阈值，因而产生假阴性结果。因此，目前的NIPT 检测技术仍存在诸多的不足，尚无法完全取代侵入性的产前诊断技术。CPM目前仍是遗传咨询中的一大难题，临床医师应充分重视CPM的存在，在咨询时更加谨慎和全面，选择正确的产前筛查和产前诊断方法，提高CPM的检出率。  参考文献：[1]边旭明 胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测[J]。实用妇产科杂志，2013,29（5）：330-333  [2] Palomaki GE，Kloza EM，Lambert-Messerlian GM，et al．DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome：an international clinical validation study ［J］．Genet Med，2011, 13（11）：913-920．DOI ：10．1097／GIM．0b013e3182368a0e[3]刘娜，景茹草，吕晓莉．母血循环胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用［J］．中国妇幼健康研究，2010，21(2)：207-210。[4] Grati FR， Malvestiti F， Ferreira JC，et al． Fetoplacental mosaicism：potential implications for false-positive and  false negative noninvasive prenatal screening results ［J］． Genet Med，2014，16（8）：620-624．DOI ：10．1038／GIM．2014．３．[5] Pan M，Li FT，Li Y，et al．Discordant results between fetal karyotyping and non-invasive prenatal testing by maternal plasma sequencing in a case of uniparental disomy ２１ due to trisomic rescue［J］．Prenat Diagn，2013，33（6）：598-601．DOI：10.1002／pd．4069[6] Dagmar KK, Michel V.Confined placental mosaicism[J], J Med Genet , 1996, 33:529-533.[7]文萍, 薛莹, 张芹. 无创产前检测胎儿染色体非整倍体假阴性两例[J] 中华医学遗传学杂志2017,34（6）883-887
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