一种应用于胎儿染色体非整倍体诊断的28重QF-PCR新方法

作者：杨旭1  潘晓芬2  王文玉2  周其伟2  曲守方3基金项目：生殖健康及重大出生缺陷防控研究（2016YFC1000300）  作者单位：1. 南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州，510515  2. 广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州，510665  3. 中国食品药品检定研究院通讯作者：曲守方【摘 要】  目的  建立一种检测胎儿染色体非整倍体的28重QF-PCR新方法，评估该方法的临床适用性。 方法  选取13号染色体上6个位点，18号染色体上6个位点，21号染色体上7个位点，X染色体上3个位点，Y染色体上1个位点和SRY，X和Y染色体共有2个位点和AMEL，位于3号染色体与X染色体的TAF9b共28个基因座，设计引物建立一管28重QF-PCR新方法。收集316例健康人群外周血样本对该方法进行杂合度和适用性评估。收集456例经核型分析的临床羊水样本进行该方法验证，分析总符合率、特异性和敏感性。结论  本研究开发的一管28重QF-PCR新方法是一种能够准确检出胎儿染色体非整倍体的非常有效鉴定方法。出生缺陷是一种先天性形态结构、生理功能或代谢异常所致的疾病。据报道，每200个新生儿中就有1个发生出生缺陷[1]。其中在产前检测到的染色体异常中染色体21/18/13/X/Y异常占比>80%[2]。迄今为止，只能通过产前筛查或诊断的方式来减少或避免出生缺陷。产前胎儿染色体非整倍体检测主要通过核型分析或其他分子学方法进行。核型分析作为染色体分析的金标准，需要进行细胞培养，费时费力。QF-PCR方法已被证明是一种非常有效的鉴定方法[3]。根据2016年发布的《QF-PCR技术在产前诊断中的应用专家共识》[4]，通过QF-PCR技术可以诊断出99.2%~100.0%的21、18、13、X和Y等染色体非整倍体异常，还可以检出三倍体和母源污染。具有经济、快速得出结果等优点，更适合于临床检测的推广应用。目前市场上基于QF-PCR技术检测该5种染色体异常并通过NMPA批准的商品化试剂盒只有达瑞生物的“染色体（13/18/21/X/Y）多重STR基因分型试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）”。该试剂盒选用20个STR位点对该5种染色体非整倍体进行判断，但仍有部分样本因无法有效判读。另外，该试剂盒在PCR阶段分3管进行，既导致成本增加也耗时耗力。因此本研究将开发出一种一管多重QF-PCR新方法检测胎儿染色体非整倍体，弥补原产品的不足，为临床提供参考依据。  01、对象与方法  1.1 研究对象（1）316例健康人群外周血样本于2019年7月至2020年6月从达瑞医学检验(广州)有限公司收集。（2）456例16~22周的孕妇羊水样本于2020年9月至2021年5月从东莞市妇幼保健院和广州妇女儿童医院收集。1.2  主要仪器与试剂干式恒温器；2720 PCR扩增仪；3500Dx基因分析仪；NANODROP 2000；核酸提取或纯化试剂盒和染色体（13/18/21/X/Y）多重STR基因分型试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）（广州市达瑞生物技术股份有限公司）（注：20重QF-PCR法）；10×PCR Buffer；TaKaRa Taq HS；dNTP；引物合成；GeneScanTM 600 LIZ® Size standard v2.0；ABI Hi-Di™ formamide等。1.3 方法1.3.1  染色体核型分析按细胞遗传学实验室常规进行培养和制片。1.3.2  荧光定量PCR技术( QF-PCR）（1）DNA 提取  按照试剂盒说明书抽提羊水和外周血基因组DNA。（2）引物设计28个位点引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。表1  28个基因座的引物信息（3）PCR反应体系及条件总体积25 μL，其中DNA 20~80 ng， dNTP 0.4 µL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）3.5 µL，引物各100 pmol，TaKaRa Taq HS 1 µL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃ 延伸50 s，共25个循环；最后72℃延伸10 min。（4）毛细管电泳和片段分析取1 μL PCR产物和13.5 μL甲酰胺、0.5 μL GeneScanTM 600 LIZ® Size standard v2.0（内标）混合。95℃变性5 min，在ABI 3500 Dx 基因分析仪和Gene mapper 4.1进行片段分析。1.3.3统计分析1.3.3.1 健康人群的杂合度计算单个STR位点杂合度计算，公式一：K代表单个STR位点杂合度；R代表单个STR位点出现双峰或三峰的样本数；Z代表总样本数；1.3.3.2 STR位点组合模式的适用性评估（1）对13三体、18三体、21三体、XXX染色体型别判读标准为相对应的染色体上至少2个STR位点出现三峰或双峰比值符合1:2或2:1的情况可判别相应染色体为三体型别，因此STR位点组合模式对13三体、18三体、21三体、XXX染色体非整倍体准确判读的适用性评估按公式二进行：公式二：（2）对XXY染色体型别判读则为确定含Y染色体的情况下，至少1个位点出现双峰且比值符合1:1的情况，因此STR位点组合模式对XXY染色体非整倍体准确判读的适用性评估按公式三进行：  公式三：P代表适用性，代表第个STR位点；代表每条染色体的STR位点总数；N代表第个STR位点杂合度；代表第个STR位点的纯合概率，。1.3.3.3 临床羊水样本的总符合率、灵敏度和特异度计算根据表2，计算28重QF-OCR新方法的结果和染色体核型分析结果对比的总符合率、灵敏度和特异度。表2  临床羊水样本结果的统计方法具体计算公式如下：总符合率 = (A1+B2+C3+D4+E5+F6+G7)/S×100%灵敏度=(A1+B2+C3+D4+E5+F6)/Spos×100%特异度=G7/S7×100%  02、结果2.1 28重QF-PCR新方法与原试剂盒的位点信息对比在原试剂盒20重QF-PCR法的基础上，28重QF-PCR新方法分别在13号染色体增加了D13S317、D13S325，18号染色体上增加了D18S390、D18S978、D18S499；21号染色体增加了D21S1437、D21S1435、D21S11；X染色体上增加了HPRTB，Y染色体上增加了DYS448，还增加了X和Y染色体共有的DXYS218、DXYS267及3号染色体和X染色体共有的TAF9b位点，具体见表3。2.2 STR位点杂合度和检测的适用性评估13号染色体6个位点的杂合度分布范围为0.70~0.87；18号染色体7个位点杂合度分布范围0.57~0.86；21号染色体9个位点的杂合度分布范围0.63~0.86；X染色体上7个位点的杂合度分布范围0.56~0.88，具体见表3。计算28重QF-PCR新方法在检测13三体、18三体、21三体、XXX、XXY的适用性P值分别为99.9%、99.3%、99.9%、96.0%、99.7%；而原试剂盒20重QF-PCR法的适用性则为97.4%、95.2%、99.8%、96.4%、99.8%。因纳入统计的男性样本较少，本研究未对Y染色体位点进行统计。表3  基因座信息和杂合度（K）统计  2.3 临床羊水样本的阳性符合率和灵敏度，阴性符合率和特异度分析根据统计结果（表4）计算，28重QF-PCR新方法与染色体核型分析结果相比，总符合率、灵敏度和特异度均为100%。4、28重QF-PCR新方法检测结果与染色体核型结果样本数统计2.4 原试剂盒未检出的临床样本适用性评估  对原试剂盒20重QF-PCR方法检测无法判断的14例羊水样本，其中1例13三体阳性，1例18三体阳性，12例正常样本，28重QF-PCR新方法均能够检出，结果与核型分析检测结果一致，具体见图1-图4。图1、1例13三体样本原试剂盒20重、28重QF-PCR新方法  图2、1例18三体样本原试剂盒20重、28重QF-PCR新方法  图3、1例阴性示例样本原试剂盒20重、28重QF-PCR新方法和核型分析图  图4、13三体、18三体和阴性样本的核心分析图谱  03、讨论  本研究开发了一种一管28重基于STR分型的快速、经济的胎儿染色体非整倍体检测方法。该方法通过一管PCR反应进行，与原试剂盒三管法相比进一步节省了试剂成本和操作时。通过316例健康人群的位点杂合度调查显示，一管28重QF-PCR新方法，与原20重三管法相比，增加的21号染色体D21S1437、D21S1435和D21S11位点的杂合度分别为0.63、0.76、0.78，Zhu等[5]报道使用包含了D21S1437、D21S1435和D21S11共11个位点应用于唐氏综合征检测，针对740例无关样本判断杂合度，得出该3个位点杂合度分别为70.4%、76.5%、81.4%，与本研究结果相类似。18号染色体增加的D18S390、D18S978、D18S499位点杂合度分别为0.57、0.74、0.75。Putzova等[6]报道了使用QF-PCR方法检测欧洲人羊水样本的13, 18, 21, X 和Y染色体异常情况，其中D18S978杂合度为70%，与本报道类似。浙江大学医学院附属妇产科医院[7]在2014年发布的专利中D18S390和D18S499位点杂合度分别为63%和72%，D18S390位点比本报道略高。13号染色体增加的D13S317、D13S325位点，杂合度分别为0.79和0.87。张晓娜[8]对21/18/13/X/Y染色体数目异常进行联合诊断的体系报道了D13S317和D13S325位点的杂合度分别为79.9%和81.2%。28重QF-PCR新方法在临床适用性方面同样表现较好。对316例样本进行分析，所有样本13、18、21、X和Y染色体均能够判读，推算其应用于XXX的适用性为96.0%，13三体、18三体、21三体和XXY型别的理论适用性均大于99%，而使用原试剂盒20重方法检测，出现26例样本无法准确判读，对于13三体和18三体的理论适用性只有97.4%和95.2%。因此28重QF-PCR新方法的适用性比原试剂盒20重QF-PCR法的更高。除此之外，28重QF-PCR新方法在XXX染色体和XXY染色体的判别方面，增加了TAF9b位点，该位点增加了X染色体的判别能力，同时还可以对X单体进行初步判断。通过临床456例羊水样本检测，28重QF-PCR新方法检测结果与金标准核型分析结果总符合率、灵敏度和特异度均为100%，使用原试剂盒20重QF-PCR方法则出现14例样本无法有效判读。这些结果均能够说明我们选择的28个STR位点能够达到更理想的临床使用效果。De Moraes等[9]通过QF-PCR分析162份羊水样本，检出率为98.14%。Tekcan等[10]人对100份羊水样本检测，与核型结果一致性为99%。本报道的结果均更高。因此本研究开发的28重QF-PCR新方法是一种能够准确检出胎儿染色体非整倍体的非常有效的鉴定方法，是一种较全面的参考方法，更适宜于临床推广。参考文献[1] Faas BH, Cirigliano V, Bui TH. Rapid methods for targeted prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies [J]. Semin Fetal Neonatal Med, 2011, 16(2):81-87.[2] Hochstenbach R, Meijer J, van de Brug J, et al. Rapid detection of chromosomal aneuploidies in uncultured amniocytes by multiplex ligation-dependent probe amplifcation (MLPA) [J]. Prenat Diagn, 2005, 25(11):1032-1039.[3] Sun L, Fan Z, Long J, et al. Rapid prenatal diagnosis of aneuploidy for chromosomes 21, 18, 13, X, and Y using segmental duplication quantitative fuorescent PCR (SD-QF-PCR) [J]. Gene, 2017, 627:72-78.[4] 荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用协作组．荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用专家共识[J]．中华妇产科杂志，2016, 51(5):321-324.[5] Zhu YN, Lu SM, Wang M, et al. Genetic analysis of STR markers on chromosome 21 in a Han population from southeast China [J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14 (1): 1718-1725.[6] Putzova M, Pecnova L, Dvorakova L, et al. OmniPlex-a new QF-PCR assay for prenatal diagnosis of common aneuploidies based on evaluation of the heterozygosity of short tandem repeat loci in the Czech population [J]. Prenat Diagn, 2008, 28: 1214-1220.[7] 浙江大学医学院附属妇产科医院．检测人18、13号和性染色体STR基因型的试剂盒．中国：201410188282.2 [P]. 2014-05-06.[8] 张晓娜．建立一种对21/18/13/X/Y染色体数目异常进行联合诊断的多重定量PCR体系[D]．唐山：河北联合大学，2014．[9] de Moraes RW, de Carvalho MHB, de Amorim-Filho AG, et al. Validation of QF-PCR for prenatal diagnoses in a Brazilian population [J]. Clinics (Sao Paulo), 2017, 72(7):400-404.[10] Tekcan A, Tural S, Elbistan M, et al. The combined QF-PCR and cytogenetic approach in prenatal diagnosis [J]. Mol Biol Rep, 2014, 41(11):7431-7436.
（责任编辑：dawenwu）