一文读懂～——在准备应用新冠核心抗原试剂之前，我们应该有哪些知识储备？杨瑞锋北京大学人民医院，北京大学肝病研究所；丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室；国家感染性疾病临床医学研究中心分中心最新出台的新冠诊治指南将病毒抗原检测提上了议事日程，国内的厂商和实验室摩拳擦掌，跃跃欲试。相比疫情伊始的抗体和火爆至今的核酸检测，抗原检测对很多人来说稍显陌生。对其临床应用场景和结果解读的讨论，让人仿佛又回到了2020年初，那时针对“务工人员到底要不要大面积检测新冠抗体”这个问题，就曾经有过热烈的讨论，看来人类总是自觉不自觉踏入相同的河流。笔者借助本文对病毒抗原检测做些介绍，希望大家在使用和解读这个标志物时能更加得心应手。01当检测病毒抗原的时候我们在检测什么？病毒分为包膜病毒和非包膜病毒两大类（见下图），前者穿外衣，多通过血液或呼吸道传播；后者没穿外衣“裸奔”，不过其“内衣”相当坚固，可忍受恶劣的环境如消化道，可通过粪-口传播。临床上，病毒的抗原检测，多半检测的是核心抗原，少部分检测表面抗原，见下图。表面抗原是包膜病毒外衣的成分，携带打开宿主细胞的钥匙，如HBV的HBsAg、HIV的gp120/gp41，SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白等；而核心抗原作为病毒的“内衣”，除了能保护其关键部位外，也为其繁衍后代提供安逸的场所和催生情愫的环境。不过，不同内衣的款式不同，有的是类球形多面体（HBV，HCV），有的接近椭球型（HIV），有的螺旋、卷曲状包绕RNA（新冠病毒），有的则是以多聚体的形式依附于病毒基因组之上（流感病毒），见下图。02病毒核心抗原检测技术难点在哪里？• 有些病毒需要将核心抗原暴露才能很好检测由于核心抗原深藏病毒内部，如果病毒外膜致密，需要破膜后将核心抗原暴露，方能检测。• 可能需要阻止核心抗体与核心抗原的结合核心抗原往往激发强烈的免疫反应，产生核心抗体，核心抗原-抗体-免疫复合物（CIC）若形成，会损害抗原检测灵敏度• 有些病毒太过吝啬，合成核心抗原量极少检测底物浓度越低，对检测试剂灵敏度和特异性的要求就更高。上述三点难点集于一身的典型的例子就是HCV核心抗原。检测时，需对样本预处理，去除外膜，暴露核心抗原，且将CIC解离（见下图）。同时，血清里能检测到的抗原浓度往往很低，考验试剂研发的技术功底。当前只有国内外少数试剂商提供试剂盒，如美国雅培、中国莱博和科美公司等。同理，HBV核心抗原检测，一直是乙肝“两对半”中缺失的那半对，可见其检测难度之大。当前能检测乙肝核心抗原的试剂商，只有日本富士瑞必欧公司。03核心抗原既然检测有难度那为何不检测表面抗原？表面抗原虽位于病毒表面更好检测，但其对宿主的免疫攻击首当其冲，比核心抗原更易变异。不论是HCV的E（envelope）蛋白、HIV的gp（glycoprotein）120/gp41，SARS-CoV-2的S（spike）蛋白，还是流感病毒（Flu）表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），这些位于表面的抗原都高度变异，不易被稳定测到，并不适合作为试剂检测的靶点。相反，核心抗原在进化中高度稳定，有稳定的表位可作为检测的靶点。HBsAg是少数几个例外之一，不同HBV毒株HBsAg变异很小，所以HBsAg成了感染筛查的重要标志物。正因其稳定性，人类得以研发出高效的预防性疫苗，从而有效地控制住了HBV的流行。04抗原与核酸有什么关系？简单理解，核心抗原和病毒核酸是“夫唱妇随”的关系，在病毒繁殖过程中缺一不可。以HIV生命周期为例，当两个拷贝的RNA被制造出来的时候，也伴随1500个p24蛋白单体被表达，并自动组合成壳状、致密的蛋白层（核衣壳），将RNA紧密包裹。HIVRNA拷贝数（copies，或称病毒载量）和p24检测信号-界值比（S/Co）值呈严格的正相关性，见下图。同样，HCV、Flu和SARS-CoV-2等也遵循此规律。HBV的核心蛋白和DNA含量也呈正相关性，但相关性不及其他病毒强，这是因为HBV会合成冗余的核心蛋白。05相比抗体，抗原检测的优势是什么？核心抗原摩尔数与核酸拷贝数遵循正相关关系，因此，检测核心抗原的临床价值和核酸重叠，即，都是病毒复制的直接指标。• 在感染早期，抗原/核酸的产生早于抗体，所以，诊断窗口期更短。• 抗原/核酸的产生不像抗体那样易受宿主免疫状态的影响，可用于免疫虚损人群。• 大面积灭活疫苗的接种，使人群中普遍产生针对各种病毒蛋白的抗体，因此，新冠抗体诊断价值消失殆尽，但抗原/核酸仍然有诊断价值。• 抗原/核酸定量还可以作为病情进展或治疗应答的标志物。06相比核酸抗原检测有什么优势？• 简单。美国FDA将核酸检测列为高度复杂的试验操作，而基于胶体金抗原快检（POCT）试验则为低难度操作，且为豁免试验（waivedtest），对操作者不需要那么高的要求，所以也可居家检测。• 便宜（虽然目前也没那么便宜）。• 快（比POCT核酸试剂还是更快些的）。• 没有气溶胶污染PCR导致核酸结果“假阳性”之虞。07抗原检测如此多优点一定会在市场上受到追捧了吧？并非如此。如上所述，抗原检测有诸多优点，但在临床，它却往往不太受待见，像个窝囊的丈夫，遭受媳妇儿和妈妈的夹板气。如前所述，HCV抗原试剂研发难度大，目前仅有国内外少数试剂商提供试剂，但市场推广仍然不太理想，因为在筛查方面，HCV抗原没有抗体简单、便宜，而在确诊和治疗监测方面，抗原又不及HCVRNA应用广泛。检验科对HIVp24试剂的应用，同样是意兴阑珊。而对于HAV和HEV而言，有IgM抗体检测，似乎就已经足够，对核心抗原检测的临床需要也没有那么强烈。08是因为病毒抗原检测有阿喀琉斯之踵吗？是的。与核酸相比，灵敏度差2-3个数量级，就是核心抗原检测最大的局限。以HIV检测为例，理想的模型中，1个HIVRNA对应750个p24单体，所以，病毒核心抗原的数量，要高于核酸拷贝数2-3个数量级，但是，核酸检测基于以聚合酶链反应（PCR）为代表的核酸扩增技术，1个拷贝的核酸，可被扩大至1012拷贝，因此核酸检测可以实现超敏检测，这就让最灵敏的抗原试剂都难以望其项背——毕竟抗原检测是基于抗原-抗体结合的免疫学技术（如化学发光技术、胶体金POCT），无法实现抗原或检测信号的指数级放大。囿于现有的免疫学检测技术，只有抗原积累到足够多，同时，当核酸复制积累到103~105拷贝的时候，抗原才能被检测到。新冠抗原的灵敏度同样不足，若应用于检测，则存在前后时间点的漏诊，见下图。此外，抗原检测的特异性也不及核酸。免疫学试验都有一定比例的非特异性反应，导致“假阳性”结果。所以，没有任何一款免疫学试剂宣称自己的特异性是100%。尽管优秀试剂会有添加抗干扰组分从而有效降低非特异性，但不可能完全消除假阳性结果。 09相比核酸检测新冠抗原检测到底有多不灵敏？以一款国外成熟应用的新冠抗原试剂——AbbottBinaxNOW核心抗原POCT试剂为例，有研究报道，100份RNA检测Ct值<30的样本中，51份可实现病毒的分离培养（提示具有潜在的传染性），而BinaxNOW可检测出51份中的45份(88.2%)。该研究提示，与Ct值动辄为40的高敏核酸试剂相比，抗原试剂在Ct值<30时，仍只有不到一半的检出率，说明新冠抗原灵敏度与核酸相比，差距为10个Ct值以上，即至少差距210倍（1024倍），这跟我们既往使用HCV核心抗原和HIVp24的数据也吻合。新冠抗原这个灵敏度，也不能保证核酸检测Ct<35的患者被抗原试剂筛出，而Ct<35被最新版的指南认为是有传染性的。10如何正视抗原检测灵敏度不足这一局限？灵敏度差，是抗原检测技术与生俱来的缺陷，特别是国内外技术主流都是基于POCT，给试剂厂商辗转腾挪继续提升灵敏度的空间并不大。因此，继续过分强调灵敏度，就有强人所难的意味，因为，枉顾技术平台的局限，一味调高试剂的灵敏度，势必会牺牲特异性，增加假阳性率。如果一些厂商为了性能数据的好看，刻意淡化试剂灵敏度低的劣势，刻意调高试剂的灵敏度，会导致试剂在真实使用时，特异性受损，假阳性结果偏多。笔者认为这种刻意的“平衡”并无必要。11不正视抗原检测灵敏度低的特点会有什么后果？所谓灵敏度、特异性，是针对试剂性能而言；应用到临床，医生关注的指标却是阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。因为，PPV能回答阳性结果有多大把握是真阳性、可确诊；而NPV可以回答阴性结果又有多大把握排除诊断，见下表。这四个貌似简单的统计学指标，却可能是很多人至今理解上的噩梦。NPV和PP除了与试剂的灵敏度和特异性有关以外，还受人群传染病流行率的影响。举例说明，若用同一款抗原POCT试剂（灵敏度和特异性都是95%）检测不同流行率的人群，得到的PPV和NPV会迥异，尤其是在流行率无限接近于0时（类似于现阶段国内的新冠流行率），PPV也急速降低，趋向于0，而NPV趋向100%，如下图。这种极端的情形下，核心抗原检测首先容易暴露的问题反而不是灵敏度不足，而是因为特异性不够而产生海量的假阳性结果，可能引起不必要的恐慌。而特异性无限接近100%的核酸试剂，则没有这种顾虑，因为PPV始终接近100%。这也是为什么核酸检测备受追捧的原因。这也提示我们，我们更应正视抗原检测试剂灵敏度不足的固有局限，哪怕牺牲一定的灵敏度，也应保证特异性不受影响。12新冠抗原试剂到底适合不适合广泛筛查？这个问题容易让人联想到2020年初，针对“务工人员到底要不要大面积检测新冠抗体”这个问题的讨论和争议。笔者认为，不论从统计学角度出发，还是从应用逻辑出发，新冠抗原同样不适合做筛查。即使抗原检测能满足前述的、特异性为100%的苛刻条件，没有假阳性结果的产生，也不适合做筛查试验。因为，抗原检测固有特点就是灵敏度低，与筛查试验对试剂高灵敏度的要求本身就相悖。由此可见，高敏、特异的核酸检测仍然无法被取代。13新冠抗原检测该如何发挥应有的价值？笔者认为，新冠抗原试剂也有其生存空间，最合适应用的场景，可能和流感抗原试剂类似。流感抗原POCT同样有灵敏度不足的局限，但在临床使用多年，基本能满足诊断需求，因为其做到了灵敏度和特异性较好的平衡——灵敏度不及流感核酸，但因此导致的漏诊率不高，且漏诊的后果并非特别严重（往往漏诊的都是低病毒载量、传染性弱，病情趋向好转的患者）；同时，特异性也控制得不错，没有高到离谱的假阳性率导致误诊。新冠抗原可以借助这个模式，即，用于临床门急诊疑似病例的诊断，阳性则有很大把握诊断为新冠，而阴性则需要进一步检测核酸。总而言之，笔者认为，还是应突出抗原检测特点——灵敏度不及核酸，但特异性好，PPV高，简单、快速，应用场景更灵活。为了灵敏度数据的好看，无节制地上调灵敏度，势必导致特异性被牺牲，这种抗原试剂可能参数好看，但往往弄巧成拙，实际使用价值被大打折扣。不要为了上市而上市——临床需要和患者利益永远是第一位的。参考文献1. J Clin Microbiol 56:e02045-172. 临床肝胆病杂志, 2011, 027(001):1-73. 中国临床新医学, 2021,14(1):1-7.4. 临床检验杂志，2021,39(11):809-812.5. https://spartanmedspine.com/covid-19-solutions/viral-antibody-tests/6. Emerg Infect Dis. 2021,27(11):2761-2767.7. https://www.fda.gov/media/137612/download （责任编辑：dawenwu）
