具核梭杆菌作为生物标志物在结直肠癌诊疗中的临床应用价值 | 述评

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）的发病率和病死率均居世界前列，严重威胁人类健康。具核梭杆菌(F. nucleatum)是一种主要定植于口腔的革兰阴性无芽孢厌氧  菌，它与CRC的发生、发展密切相关，随着研究的深入，其被发现或可作为生物标志物在CRC的诊断中发挥作用。目前对于F. nucleatum的检测主要基于以下几类标本：组织标本、粪便标本、唾液标本和血清标本。（作者：王毅峰  陈文丹  张欣  张义）F. nucleatum在CRC组织中的表达及意义： 目前，在F. nucleatum与CRC的研究中应用最广泛的样本是组织样本，依托组织样本，可以直接分析F. nucleatum的丰度与肿瘤的病理特征以及表观遗传学改变之间的关系。CRC组织的全基因组测序发现了CRC中存在丰富的F. nucleatum，随后大量的基于qPCR、免疫组化等方法的研究证实了F. nucleatum在结直肠发生、发展以及转移中的作用。研究发现，肿瘤组织中F. nucleatum的丰度与CRC的部位、侵袭深度、转移等相关；在表观遗传学方面，F. nucleatum的丰度与CRC的CpG岛甲基化表型、BRAF突变以及微卫星不稳定状态等相关；另外，F. nucleatum与CRC患者的化学耐药以及化疗后的复发相关，这些均直接或间接地影响CRC患者的预后。并且多项研究结果表明，组织中F. nucleatum丰度高的患者其预后明显差于F. nucleatum丰度低的患者。综上所述，组织中F. nucleatum的检测可作为CRC诊断、分子分型、疗效评价及预后评估的重要手段。粪便中F. nucleatum检测在CRC诊断 肠道菌群与CRC的关系一直是近年来研究的热点，由于细菌约占粪便干重的60％，因此粪便成为了研究肠道菌群的主要对象之一，无创取样的粪便F. nucleatum检测在CRC诊断中得到广泛应用。Yachida等[15]通过对616例受试者的粪便标本进行宏基因组学分析，发现CRC患者的微生物群组成与多发性息肉样腺瘤患者有很大差异，并且从黏膜内癌到CRC晚期，患者粪便中F. nucleatum的丰度不断升高。Liang等[18]的研究结果显示，粪便F. nucleatum诊断CRC的AUC为0.850，在无症状CRC中这一诊断效能不仅没有降低，反而有轻度提升（AUC = 0.856），提示粪便F. nucleatum对于无症状CRC也有较好的诊断能力，有助于早期无症状CRC患者的筛查。唾液中F. nucleatum检测在CRC诊断中的应用： 口腔和肠道是通过胃肠道连接的解剖学连续区域，由于唾液和消化后的食物通过这两个位置，也是一种化学相连，因而口腔微生物组可能与肠道微生物组的内容和变化有关。F. nucleatum在口腔中广泛存在，全基因组测序发现CRC组织中与匹配的同一患者唾液中的F. nucleatum具有高度的同源性，这一结果也在F. nucleatum任意引物多重PCR中得到证实。口腔F. nucleatum可通过消化道下降或在咀嚼、日常卫生活动或牙科手术引起的频繁短暂菌血症期间通过血行途径转移到CRC。2016年的2项研究专门评估了CRC患者口腔菌群中F. nucleatum的存在及其数量，在这2项研究中CRC患者和健康对照组中F. nucleatum的检出率无明显差异[19-20]。在Guven 等[21]的研究结果显示，CRC患者唾液中F. nucleatum的丰度明显高于对照组，但缺乏诊断价值。我们课题组基于多重qPCR的方法对CRC患者、增生性肠息肉患者、腺瘤患者和健康对照者唾液中的F. nucleatum进行系统分析，发现CRC患者唾液中F. nucleatum水平明显升高，唾液中F. nucleatum诊断CRC的ROC曲线下面积可达0.841，敏感度和特异度分别为71.5%和82.1%，其诊断价值明显优于血清CEA、CA19-9及其二者的联合。同时发现，唾液中F. nucleatum是CRC患者OS和DFS的独立预后危险因素。另外，Hanie Morsi等[22]提出了一种从唾液中检测F. nucleatum亚种的蛋白质组学方法（基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱技术），该方法可更好地了解F. nucleatum亚种的可能个体生物学作用，这或可成为一种以特定亚种为目标的筛查、预防或治疗CRC的方法。血清中F. nucleatum抗体检测在CRC诊断中的应用：通常微生物可作为抗原在体内引起免疫反应，评估肿瘤相关微生物抗原的免疫反应是感染相关癌症的早期诊断方法之一，如针对人乳头瘤病毒(HPV)和幽门螺杆菌(Hp)抗体的血清学检测分别用于宫颈癌和胃癌的筛查。有学者报道， F. nucleatum感染的患者和慢性口腔感染F. nucleatum的小鼠体内可产生明显的体液免疫反应[23-24]。Gemmell等[25]发现F. nucleatum诱导产生的抗体与口腔其他微生物不具有交叉免疫反应，这为基于F. nucleatum抗体血清学检测的CRC诊断提供了一种可能。临床检测发现早期CRC患者血清抗F. nucleatum抗体IgG和IgA效价均与良性结肠疾病患者和健康对照者相比显著升高[26]，但与晚期CRC相比仅略有升高，说明在CRC早期即可检出抗F. nucleatum抗体，并且该抗体水平在相当长一段时间内可保持相对稳定。另外，与抗F. nucleatum-IgG相比，抗 F. nucleatum-IgA对CRC表现出更好的诊断价值。通过ELISA方法检测血清抗F. nucleatum抗体并评估其诊断性能，发现抗F. nucleatum-IgA诊断CRC的敏感度为36.43%，特异度为92.71%。将其与CEA联合，诊断CRC的效能进一步提升（敏感度为53.10%， 特异度为96.41%，AUC = 0.848）。抗F. nucleatum-IgA与CEA和CA19-9联合检测可进一步提高对早期CRC的诊断能力，敏感度可达27.27%，这在不影响特异度（96%）的情况下很大程度弥补了CEA（9.09%）和CEA联合CA19-9（16.36%）诊断早期CRC敏感性低的不足。因此，抗F. nucleatum-IgA在早期CRC的大规模筛查方面具有重要价值。综上所述，F. nucleatum在CRC诊断方面具有一定的应用价值。不同类型样本中F. nucleatum的检测由于标本类型与检测方法的不同在CRC的诊断价值方面存在差异。细菌学方法由于其特异性高，一直被认为是细菌检测与鉴定的金标准，但由于其对样本取材、转运、培养等的要求高，培养周期又长，因而不宜作为F. nucleatum的常规检测方法。组织样本中F. nucleatum的检测较其他样本不同的是可以进行免疫组化检测，除了定性、定量外，还可以进行定位，其敏感性和特异性均高于传统检测方法，但因其对实验条件及实验人员的较高要求，以及组织标本需要侵入取材等，难以推广于临床。基于血清样本的F. nucleatum抗体检测，取样方便，检测快捷，但其敏感性低，容易漏诊，主要与其他血清学指标联合检测。可对多种标本类型进行检测的qPCR技术是目前常用的检测F. nucleatum的分子生物学方法，F. nucleatum的16S rRNA是常用的检测靶点，qPCR方法不受样本类型的限制，可对组织、粪便、唾液等多种类型的样本进行大样本量检测，在此基础上选择合适的样本类型，可提高F. nucleatum对CRC的诊断效能。  【参考文献】[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. 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