化学发光与多项技术联用

CLIA作为一种试剂、方法、仪器三位一体的检测方法，融合了多学科的知识，其发展必然与相关学科息息相关。目前基因工程抗原抗体制备的出现，促进CLIA方法不断完善，应用范围不断扩大。CLIA与多种技术联用逐步实现多组分同时快速检测，进一步推动CLIA在环境分析、食品分析、药物分析、纳米分析、芯片分析以及突发性事件分析中的应用。1. 化学发光与侧向流动免疫分析1.1侧向流动免疫分析侧向流动免疫分析（LFIA），也称为免疫层析分析（ICA），通常用于定性、半定量检测，是一种简单、经济、高效的检测方法，旨在检测目标分析物的存在或不存在。LFIA结合了均相免疫分析的速度，并以各种不同的方法分离反应和未反应的化合物。LFIA具有以下特点：1）流经载体的样品能够分离反应中未反应产品的部分，无需任何额外的沉淀或洗涤程序；2）LFIA试纸条由相对简单的层压纸结构组成。样品通过被动毛细管力迁移，目标识别最初发生在抗体标记的金纳米颗粒（AuNP-Ab偶联物）穿透偶联垫并通过硝酸纤维膜（NC膜）迁移过程中；3）捕获Abs然后识别NC膜测试线上的目标共轭复合物，导致AuNP-Ab积累并产生红色视觉响应，其强度取决于目标浓度。1.2 侧向流动化学发光免疫分析LFIA条带使用金纳米颗粒作为信号指示剂，当检测低浓度分析物时存在比色响应较低的问题时，可通过酶（如辣根过氧化物酶HRP）催化的LFIA与化学发光（CL）相结合，提高LFIA的转换方式。LFIA-CL具有以下特点：1）当使用HRP作为标记时，条带的pH值需要从中性变为碱性；2）灵敏度主要取决于含有抗体和酶的偶联物的设计，分析物浓度的化学发光信号与分析物识别所涉及的酶的量成比例产生。CL与LFIA联合使用可满足人们对简便、快速定量检测的需求，其具有快速、简便、便携等优点，在样品检测中有着广泛的应用，为低成本、省时、多元的分析策略开辟了一条新的途径。2. CLIA与微流控芯片2.1 微流控芯片微流控芯片又称微流控芯片实验室或片上实验室（LOC）是将样品处理、反应、分离、检测等涉及化学和生物实验的常规操作集成在几平方厘米的芯片上的技术平台，可实现低耗、快速、高效的分析。微流控芯片具有以下特点：1）微观结构容纳流体。如微通道、微反应室等微功能部件，产生一系列微流体的特殊效应，如层流效应、表面张力和毛细管效应、快速热传导效应和扩散效应，有利于流体的精确控制和快速反应；2）微米级结构。流体显示出与宏观尺度不同的特殊性质，显示出独特的分析性能；3）可与各种单元的灵活组合和集成。实现自动化操作、高通量检测和低试剂消耗，防止人为干扰和污染，以及完成高效的重复实验；4）良好兼容性。易于与其他技术设备集成。2.2 微流控化学发光免疫分析微流控芯片与化学发光结合可进行生物标志物的定量检测，再利用磁珠可提高免疫分析的灵敏度，并以微流控形式进行快速分析，实现了试剂混合、磁珠分散、孵化、芯片腔体内目标捕获和检测。传统的CLIA受限于设备要求大、操作流程繁琐、消耗大等问题。CLIA与微流控芯片的整合有望为免疫分析提供简单、低试剂消耗和廉价的平台，并促进高通量筛选和POCT诊断。3. CLIA与流动注射分析3.1 流动注射分析流动注射分析（FIA）被定义为“从注入一定体积并在无空气分割的连续载流中得到分散的试样区带形成的浓度梯度中收集信息的技术”。仪器主要包括蠕动泵、注样器阀、反应器、流动式检测器和信号读出装置。FIA具有的特点是：1）待测反应产物的峰形信号是经过流动式检测器时物理分散过程和化学反应状态的综合反映；2）非平衡状态下进行化学分析。微型化、集成化、连续监测和过程控制的分析手段。3）流动注射技术只有同特定的 检测技术结合才能形成一个完整的分析体系，因此它具有广泛的应用性。3.2 流动注射化学发光免疫分析流动注射分析（FIA）是一种连续流动分析技术，它与CLIA相结合发展成为了流动注射化学发光免疫分析（FI-CLIA）。FI-CLIA具有以下特点：1）速度快、重现性好、自动化程度高、灵敏度高、试剂用量少等；2）计算机控制，具有自动化监测和数据处理等优点。3.2.1 FI-CLIA有两大类型，分为均相FI-CLIA和非均相FI-CLIA。1）均相FI-CLIA不需要分离，直接在同一介质中进行，在线测定抗原、抗体结合的物理特性且基本都用竞争法检测。尽管均相FA-CLIA操 作较简单，但由于样品中杂质对测定的干扰较严重而且能用于均相测定的反应体系非常少，所以均相FIIA的应用受到一定的限制。2）非均相FIIA采用固相分离方式，将抗原或抗体固定在一个固相载体上，并用物理方法可充分地将抗原抗体复合物与未结合的标记物和样品中的杂质成分分离除去，然后检测与复合物相结合的标记物。这种方法可使测定的灵敏度和重复性提高。4. CLIA与毛细管电泳4.1 毛细管电泳毛细管电泳免疫分析(capillary electrophoresis immunoassay, CEIA)是一种检测抗原抗体和抗原抗体复合物的分析方法。CEIA具有以下特点：1）减少洗涤步骤，提供高效的分离分析、高灵敏度检测、小样品消耗量，且自动化比较容易。2）方法简便，且能够提供一种自由的进行单组分免疫分析和多组分免疫分析。这种优势得益于毛细管电泳强大的分离能力，它能够很好地将抗原抗体和其免疫结合物釆用某种电泳模式进行分离。4.2 毛细管电泳化学发光免疫分析化学发光的高灵敏度与毛细管电泳的高分辨以及免疫分析的高特异性相结合，是一种理想的分析方法。化学发光作为毛细管电泳的检测器，从原理上来说不需要光源，只需要光电倍增管或者其他光电转化装置来接受化学反应过程中所发出的光子并对光强度进行测量比较，就能够达到物质定量分析的目的。由于毛细管电泳分离进样量比较少以及分离过程中所需要施加高压电源，而化学发光试剂的添加需要适当的溶液传输，给实验操作带来很多困难。所以 选择最佳的接口方式对于仪器操作的安全性和提高分离效率及检测灵敏度都非常重要，也是化学发光能否成功作为毛细管电泳检测器的关键。5. CLIA与高效液相色谱（HPLC）5.1 高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种具有高效、快速及应用广泛的现代分离技术，它在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论和技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及较高灵敏度检测器发展而成的现代液相色谱分析方法。HPLC在生物化学、临床医学、食品检验、石油化工等领域得到广泛应用，并成为解决实际分离和分析必不可缺的工具。与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法具有以下优点：1）应用了颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；2）采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样分析需数分钟，复杂试样在数十分钟内即可完成；3）广泛使用高灵敏检测器，大大提高灵敏度。5.2 CLIA与高效液相色谱化学发光不需要外加光源和灵敏度高两大特点使化学发光分析成为成为微量检测法研究的热点。HPLC具有分离效能高、分析速度快等特点。将化学发光的高灵敏度、设备简单、线性范围宽等优点和液相色谱高效分离效率相结合，在痕量及超痕量分析研究和应用中显示出巨大潜力，具有十分广泛的应用前景。高效液相色谱与化学发光技术联用形成高效液相色谱化学发光免疫技术（HPLC-CL），可以完美地实现高分辨、高灵敏度的检测。HPLC-CL具有以下优点：1）特异反应。抗原或抗体得到很好的保留，实现分离富集的作用；2）离线分析转变为在线分析。广泛应用于抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体、病毒、亚细胞化合物及小分子污染物的分析并从单目标物向多种目标物同时检测发展。3）多抗体或簇特异性抗体固定到一根柱子上，或将固定有不同抗体的亲和柱串联起来，可实现同时对多种目标组分进行分析。
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