作者：艾米•卡彭特（Amy Carpenter）引入新一代测序分析以检测移植人群中CMV（巨细胞病毒）抗病毒耐药性的18个月后，Matthew Binnicker博士（ABMM）在AMP演示中分享了一位患者的病例和他的实验室更广泛的经验。梅奥诊所临床病毒学主任兼检验医学和病理学系实践副主任Binnicker博士在11月的AMP2020虚拟演讲中说，NGS检测的诊断优势是更早地检测移植患者的耐药性和更好地管理巨细胞病毒。他说，随着美国移植数量的增加，“我们将看到越来越多的人接受高水平的免疫抑制药物，这将使他们罹患巨细胞病毒等传染病的风险增加。”Binnicker博士也是实验室医学和病理学教授，他讨论了梅奥诊所的一个病例:一位有多囊肾病史的67岁女性患者，她接受了活体、非亲属供体肾移植手术。移植前，她的血清状态被确定为与CMV IgG不匹配:“供者血清呈阳性，但受体血清呈阴性。“患者的EB病毒血清状态为供体阳性、受体阳性。该患者在手术后五个月出现转氨酶升高，并伴有两天腹泻。由于这些临床表现和术前患者的血清状态，研究小组要求在血浆样本中检测巨细胞病毒载量，报告显示其升高到130,000 IU/mL——“与这些临床表现一起，这一结果肯定会令人担忧，因为在移植术后可能存在巨细胞病毒感染疾病，”Binnicker博士说。该患者开始服用更昔洛韦，第二周进行的一项测试发现，CMV病毒载量增加了超过100万IU / mL。“即使抗病毒药物已经开始使用，看到病毒载量增加也不太令人担心。我们至少需要等上几周，才能开始考虑耐药性问题或改变管理方法，”Binnicker博士说。他说，患者的病毒载量在接下来的8至10周内显示出“不错的反应”，稳定在100至1,000 IU / mL之间。但是，在报告后第11周和第12周，使用更昔洛韦治疗时，患者的病毒载量反弹至高水平。“我们开始非常担心这个人体内产生了耐药性。”Binnicker博士说，CMV的临床表现“可能是非特异性的，医疗团队难以诊断和管理，这使得诊断测试至关重要”，Binnicker博士说。CMV综合征可能包括发烧和中性粒细胞计数升高，是一种常见表现。“当一个人出现该类别的CMV综合征时，测试很重要。”其他临床表现为肺炎，肝炎和胃肠道疾病，伴有恶心，呕吐或腹泻，如67岁患者所见。他说：“在某些情况下，中枢神经系统疾病也会发生。”Binnicker博士说，长期接触抗病毒药物(中位5个月)，移植前缺乏免疫(供者血清阳性/受体血清阴性)，接受强免疫抑制治疗方案，以及抗病毒药物输送不足都是CMV抗病毒药物耐药的危险因素。CMV中抗病毒抗药性的发生率取决于移植的类型和患者，但是据测量，在实体器官移植人群中，抗病毒抗药性的发生率为5％至12％，根据人口研究和测试,干细胞移植受者之间的14.5%和1.7之间。肺移植(18%)和肠或多器官移植(31%)的受者发病率更高。Binnicker博士说，两个CMV基因中的特定突变与抗病毒耐药性有关。我们看到的第一个和最常见的与抗病毒药物耐药性相关的突变基因是UL97，”它编码激活更昔洛韦和缬更昔洛韦所需的激酶，缬更昔洛韦是移植患者治疗CMV最常见的药物之一，他说。UL97中发生的特定突变可以阻止这些药物的磷酸化或激活。巨细胞病毒UL54基因(编码DNA聚合酶)的突变并不常见，但可能会有更严重的后果。除了更昔洛韦和缬更昔洛韦外，这些突变还与对西多福韦和膦甲酸的抗病毒治疗产生抗性有关。Binnicker博士说：“在某些情况下，多种药物存在交叉耐药性，在这些患者中我们选择的治疗方案较少。” 例如，突变D301N可以对更昔洛韦和西多福韦产生交叉耐药性。“出现了新种类的药物，我们发现其他CMV基因（例如UL56）中可能存在突变，或者在UL89和UL51中较少见，这可能导致对新型药物（如莱特莫韦（letermovir））的耐药性，” Binnicker博士说:“。随着更多测序工作的进行，UL56中的突变列表不断增加。长期（大于六周）抗病毒治疗期间持续或反复出现高病毒载量，增加了人们对抗病毒耐药性的怀疑。Binnicker博士说：“正如在案例中所强调的那样，该患者接受更昔洛韦治疗8至10周，然后显示出其病毒载量上升。” “尽管正在接受治疗，但病毒载量仍处于高水平的患者，可以使我们沿着对耐药菌群产生的思考。”罗切斯特梅奥诊所的Binnicker博士及其同事开发了用于检测CMV耐药性的下一代测序方法。该方法于2019年5月开始常规使用，需要从执行过病毒载量的个体中获取血浆样品。他说：“我们要求病毒载量为500 IU / mL或更高。”基于CMV变异数据库的突变（红色粗体字：≥15％）；（蓝色粗体：<15％但≥5％）“一旦我们获得了样本，我们就通过自动提取的方式从样本中恢复DNA。然后我们对病毒核酸进行两个单独的聚合酶链反应(pcr)，扩增整个UL97和UL54基因。“我们运行凝胶，并检查扩增子的大小是否正确。然后，我们将产品（UL54和UL97扩增材料）混合在一起，制成标准浓度，然后将其发送到我们的下一代核心测序设备，在那里，此序列将在Illumina MiSeq上生成。”一旦测序完成，Binnicker博士的团队将序列数据上传到高级生物实验室，该实验室开发了一种生物信息学分析软件程序。“该软件会查询该序列文件，并将其与参考数据库（缺乏抗性相关突变的野生型CMV）进行比较。”在30分钟内，他和他的团队收到了ABL的报告，总结了对西多福韦，膦甲酸或更昔洛韦的抗药性或敏感性（图1）。Binnicker博士说：“我们可以更深入地研究数据，并查看与参考数据库相比识别出的特定突变。”CMV突变分析报告列出了在UL54和UL97中鉴定出的所有突变，并区分了与抗病毒抗性相关的突变，如果阈值等于或高于15％，则以红色表示，如果含量低则通过蓝色表示，读数的百分之五到百分之十五。“为了监测和发现，我们想要找出那些低水平的突变，也就是那些在5%到15%之间的突变，”宾尼克博士说。“如果我们在一个病人身上看到耐药性突变，比如说，7.93%，我们想把这个突变剔除，这样我们就可以跟踪它。我们可以看到，当患者接受抗病毒治疗时，病毒突变是如何出现或演变的。Binnicker及其同事对测试进行了数月的验证，以确保其准确性，在此期间，他们将其与Sanger测序进行了比较。他们确定了检测限度，确定了可产生可重复且准确的测序数据的最低病毒载量。他说:“我们感兴趣的是评估该方法是否能够识别样本中是否存在混合病毒种群，并能够告诉我们在大多数野生型背景存在的情况下，是否有一个少数亚种群可能具有耐药性。”Binnicker博士的团队还使用预期的临床样本研究了分析的特异性和精密度。研究小组发现Sanger和NGS方法在11个临床样品中预测抗病毒药敏性方面完全一致（图2）。“我们还看到对更昔洛韦，西多福韦和膦甲酸的抗药性达成了良好的协议，因此，在易感性和抗药性水平上，两个平台之间约有97％的总体协议。”在一个患者样本中，NGS方法产生了更昔洛韦耐药性，而Sanger方法将其称为膦甲酸耐药。Binnicker博士说:“我们对这个问题进行了进一步的测序，但不能确定Sanger法的结果会引起福斯卡耐药，所以我们认为更昔洛韦在这种情况下最有可能是准确的。”对比较数据的更深入研究揭示了每种方法在调用UL97和UL54基因的特定突变上的表现如何。他说：“在我们的研究中检测到的绝大多数突变表明两种测序方法之间具有一致性。” NGS检测到的某些突变未被Sanger检测到，“当我们查看这些突变的发生率时，在大多数情况下，它们不到20％，这通常是Sanger能够识别出这些突变的阈值。”宾尼克说。“这可能要求提高下一代测序的灵敏度或区分能力。”他补充说，有两个样品显示Sanger检测到突变，但NGS未检测到，但“我们无法通过随后的测序研究确认那些突变”。NGS和Sanger测序之间在临床血浆样品中确定抗病毒药物耐药性的总体一致性为96.8％。其他验证研究证实，LOD在500 IU / mL时具有可重现性和高度准确性。在混合病毒种群研究中，Binnicker博士和他的同事们采集了已知的UL97和UL54突变的临床样本，并以不同的比例进行混合。“我们能够通过下一代测序方法检测和区分预期的突变，”他说。他们还想知道，在大多数野生型背景下，一个少数亚群的突变患病率能低到什么程度，以及NGS是否能区分它们。该研究小组将野生型CMV与已知具有不同比例的各种UL97或UL54突变的CMV混合在一起。他说：“我们确定，如果次要亚群的含量在15％或以上，我们就可以再现性和准确地鉴定出该突变并将其报告出来。”Binnicker博士说：“在我们开始使用下一代测序技术时，我们发现的令人着迷的方面之一就是该技术能够鉴定出可能具有新的耐药性突变的病毒的低水平或次要亚群。” “使用Sanger，你需要至少有20%的病毒群存在抗药性，才能将其与缺乏抗药性的野生型毒株区分开来。” “使用NGS，我们可以将患病率降低到10％到15％，并能够将病毒种群彼此区分开。如果不及早发现，少数亚群可能会成为主要人群。”他说：“涉及序列覆盖和阅读时，Sanger通常在约600至700个碱基对后就其测序质量而言分崩离析。NGS可以对数千个碱基对（甚至是全长UL97和UL54基因）进行测序，从而获得高质量的结果。”与Sanger相比，NGS的LOD更低（NGS为500 IU / mL，“在某些情况下甚至更低”）而Sanger为1000 IU / mL。与Sanger相比，NGS的系统吞吐量（系统在单位时间内处理请求的数量）要高得多。在比较这两种测序方法时，在Sanger方法中发现的唯一优势是财务上的优势。Binnicker博士说：“ Sanger绝对比下一代测序便宜，”尽管他预测NGS的成本将降低，并指出移植患者的利益可能值得NGS的更高成本。“当我们处理复杂的案件时，需要及早确定抗药性是否正在出现时，下一代测序在这些高风险人群中是一个很好的应用。”自2019年5月实施CMV NGS方法进行常规检测以来，Binnicker博士的实验室发现，在所有检测样品中，有20％至25％的耐药相关突变处于一定水平。“这表明，当有治疗失败或怀疑耐药性的证据时，通常会下令进行此测试，而且我们肯定会看到下一代测序方法能检测到相当高的耐药率，”他说。Binnicker博士说，通过追踪使用NGS鉴定的特定突变，他们发现L595S突变“是我们发现频率最高的突变”。“所有显示出抗性的样品中约有28％以及所有测试样品中的4.7％具有该特定突变。”他说，A594V / P / T位置的突变发生在约26.5％的抗性样品中，或约4.5％的所有受测样品中。M460I / V的位置出现在约20％的电阻样本中，或占所有测试样本的3.2％。在C603W（占抗药性样品的16.2％），C592G（5.9％）和H520Q（4.4％）的位置发现了较不常见的突变。Binnicker博士说：“我们确实观察到了在同一样品中具有多个抗药性相关突变的样品。” “在有抵抗力的人中，这种情况发生的时间约占22％；我们看到至少两个或多个特定突变。” 他们所见最多的是同一样品中的四个抗药性突变。他说，较少常见的突变发生在UL54基因中。K513N突变发生在约4.4％表现出抗性的样品中，或少于所有测试样品的1％。“我们看到一些样品中存在UL54突变，但仅占测试样品总数的百分之一。”回到案例研究，这位67岁的肾移植受者出现发热和腹泻，最初对更昔洛韦有反应，在移植后11或12周的病毒载量为280,000 IU / mL。Binnicker博士说，使用NGS方法，“我们在UL97 [L595S和L595F]中检测到两个产生更昔洛韦耐药性的突变，因此该患者转为使用膦甲酸。”一个月后，患者的病毒载量增加到180万IU / mL。一个月前看到的两个突变的患病率现在急剧上升。Binnicker博士说：“但是我们看到了一个新的突变-E756N突变-即将达到对膦甲酸酯耐药性的测试阈值[15％]，这可以解释病毒载量的增加。”Binnicker博士的团队计划在其NGS分析中添加UL56，以确定可能的莱特莫韦（letermovir）耐药性，并研究与Sanger测序相比，常规使用NGS是否可改善结果。他的团队还将探讨在开始治疗之前是否应对所有移植病例进行基线测序，以及是否可以使用NGS识别新的耐药相关突变。文章来源于：https://www.captodayonline.com/-End- （责任编辑：dawenwu）
