外周血外泌体非编码RNA检测在肺癌诊断与治疗监测中的临床价值

检验视界A-A+临床诊断采用有创检测往往会对肿癌患者造成伤害，因此，迫切需要开发无创、有效的检测方法。作者：吴静  沈佐君单位：中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院 癌症的早期发现可以显著降低癌症患者死亡率并延长患者生命，为此很多研究者致力于探索新技术以检测肿瘤的早期迹象。癌症生物标志物广泛存在于生物体内，例如DNA，mRNA，酶，代谢物，转录因子，蛋白质和细胞表面受体，以及体液中发现的整个肿瘤细胞。它们可用于风险评估、诊断、预后、预测疗效和疗效观察。尽管肺癌死亡率在下降，但大多数患者仍被诊断出患有晚期或转移性肺癌，导致治疗效果不佳[1]。因此，如果在出现临床症状之前能够早期检测到癌症，这可能是降低癌症死亡率的有效手段。尽管肺癌的基础研究颇受重视，治疗方案和新药开发不断地更新，但患者的预后并不令人满意。目前临床上迫切需要找到能预测手术后肺癌复发的生物标志物，以改善患者的预后。越来越多的研究表明，各种细胞释放的外泌体可以用作不同细胞之间的信息交换的介质，外泌体miRNA参与肺癌的发生和发展并发挥各种作用[2]。研究结果表明，外泌体miRNA可以用作肺癌的早期诊断和预后标志物，但它们在肺癌患者中的确切作用仍然需要进一步研究[3]。癌细胞中外泌体分泌的增加和失调与肿瘤发生发展相关。外泌体miRNA生物标志物在许多癌症中发挥着重要作用，例如鼻咽癌，肺癌和结直肠癌[4]。最近的研究显示，在所有人体体液中检测到外泌体miRNA，可用作肺癌检测的非侵入性生物标志物。外泌体与肺癌的发生密切相关，肿瘤来源的外泌体可通过调控多种途径参与肺癌的发生和发展，如增强肿瘤血管生成和血管通透性、参与上皮-间充质转化和促进化疗耐药，这些证据表明外泌体在肺癌的发生发展中起着至关重要的作用，为非小细胞肺癌的治疗提供了新的前景，有待进一步研究。一、外泌体miRNA作为肺癌的诊断生物标志物近年来，研究人员高度关注外泌体miRNAs作为癌症检测和筛查的诊断生物标记，研究外泌体miRNAs的功能及其作为癌症生物标记物的潜力。临床工作者观察了病例组与对照组血浆、血清或肺泡灌洗液中外泌体miRNAs的表达水平，期望找出具有临床价值的差异。在该领域的早期研究中，Cazzoli等人分析了肺腺癌患者、肺肉芽肿患者和健康吸烟者血浆外泌体miRNAs的表达水平。作者通过PCR验证发现外泌体miRNAs(miR-378a、miR-379、miR-200b-5p和miR-139-5p)可以用于区分肺癌患者和健康人群，外泌体miRNAs(miR-151a-5p、miR-154-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-30a-3p)可以区分肺腺癌患者和肺肉芽肿患者[5]。6种失调的血浆外泌体miRNAs(miR-19b-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-584-5p、miR-425-5p和miR-409-3p)可以将肺腺癌患者与健康志愿者区分开来。在训练、测试和外部验证阶段，受试者工作特征曲线下的面积分别为0.72、0.74和0.84。此外，除miR-584-5p外，所有已鉴定的miRNAs在肺腺癌组织中均显著上调[6]。其他相关证据来自Jin等人的研究，作者认为肺腺癌患者血浆外泌体miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p的变化显著，而miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b在鳞状细胞癌患者中是特异性的。作者还评估了这些miRNAs在非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌分类中的准确性，得到的受试者工作特征曲线下的面积分别为0.899、0.936和0.911[7]。在训练、检测和外部验证阶段进行了qRT-PCR，4种外泌体miRNA(miR181a-5p、miR-21-5p、miR-106a-5p和miR-93-5p)组合可用于肺鳞癌检测，训练、测试和外部验证阶段4个miRNAs的受试者工作特征曲线下的面积区域分别为0.795、0.827和0.914[8]。与血浆样本类似，在许多对人体的研究中，也对血清来源的外泌体中miRNAs的表达水平进行了研究。三种外泌体miRNAs组合(miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p)在男性肺鳞癌患者中具有有效的诊断价值(受试者工作特征曲线下的面积=0.832)。有趣的是，目前报道了三种miRNAs的组合在区分肺鳞癌和肺血肿时也具有高度准确性，并指出受试者工作特征曲线下的面积值为0.900。与健康对照组相比，肺腺癌患者的血清外泌体中miR-140-5p表达水平增加[9]。最近的一项研究报告显示，与健康对照组相比，非小细胞肺癌患者外泌体miR-17-5p的表达明显上调。对于外泌体miR-17-5p，作者获得的受试者工作特征曲线下的面积为0.746。当miRNA与CEA、CYFRA21-1和SCCA这三种已知的诊断非小细胞肺癌的血液学标志物联合使用时，受试者工作特征曲线下的面积值上升至0.844[10]。一个有意义的研究结果是，在早期阶段，早期非小细胞肺癌患者的血清外泌体miR-126水平与对照组相当，而晚期非小细胞肺癌患者的血清外泌体miR-126水平显著降低。外泌体miR-126甚至可以区分健康对照和早期非小细胞肺癌患者，并且比血清中检测到的miR-126数量更显著[11]。在早期非小细胞肺癌患者血清中4种miRNAs(miR-21-5p、miR-141-3p、miR-222-3p、miR-486-5p)组合和2种miRNAs(miR-146a-5p、miR-486-5p)组合表达水平显著升高。上述4种血清miRNAs与2种血清外泌体miRNAs联合可用于早期非小细胞肺癌患者的诊断，受试者工作特征曲线下的面积可达0.960，敏感性为85.42%，特异性为92.50%[12]。此外，研究发现肺癌患者血清外泌体miR-106b含量高于健康志愿者，miR-106b水平与TNM分期和淋巴结转移相关。细胞系中外泌体miR-106b的含量非常高，能增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力，还能增加细胞系中转移相关蛋白(MMP-2和MMP-9)的表达[13]。尽管研究人员对与肺癌早期检测相关的外泌体miRNA谱感兴趣，但据我们所知，只有Poroyko等人使用测序研究了小细胞肺癌、非小细胞肺癌和健康对照中的血清外泌体miRNA表达量。该研究表明，不同类型的癌症患者、肿瘤携带个体和对照个体之间的外泌体含量是不同的。在癌症患者和对照组中，目前已经鉴定出17个不同表达的miRNAs[14]。肺腺癌患者血清外泌体miR-7797的表达量最高和miR-98-3p的表达量最低。当两种miRNAs联合使用时，诊断效果更好(受试者工作特征曲线下的面积=0.816)。作者还在体外证明，增加A549细胞中miR-7797的表达可以抑制肺癌细胞的增殖[15]。有研究人员从非小细胞肺癌患者和非肿瘤患者血浆和肺泡灌洗液中分离出外泌体，然后分析外泌体miRNAs的表达量。该研究首次比较了血浆和肺泡灌洗液中的外泌体数量，证明两组患者的血浆外泌体数量都高于肺泡灌洗液，血浆外泌体中miRNAs的含量明显高于肺泡灌洗液。作者认为血浆中有两种特异性的外泌体miRNAs(miR-126和miR-144)，肺泡灌洗液中有两种特异性的外泌体miRNAs(miR-302a和miR-302c)[16]。同样，肺腺癌患者肿瘤组织和肺泡灌洗液中外泌体miR-126和let-7a水平较高[17]。其他相关证据来自Berta等人的工作，作者开辟了一种方法，将胸腔液和灌洗液中的外泌体miRNAs作为一种尚未探索的生物标志物来源。具体来说，肺腺癌是通过miR-1-3p、miR-144-5p和miR-150-5p这三个外泌体miRNAs进行特异性诊断的。作者还评估了miR-1-3p、miR144-5p和miR-150-5p的诊断能力，得到的受试者工作特征曲线下的面积分别为0.914、0.939和0.925[18]。二、外泌体miRNA作为肺癌的预后生物标志物骨髓瘤、肝癌和前列腺癌患者血液中的外泌体miRNAs检测结果显示了识别患者预后方面的临床相关性。外泌体miRNAs谱也可以为肺癌的监测提供可靠的见解。事实上，在肺癌中，使用外泌体miRNAs作为临床重要的生物标志物在其预后和预测潜力方面仍然相对有限。miR-21在肺腺癌患者胸腔灌洗液中显著升高，并预测患者存在较差无病生存期[19]。非小细胞肺癌患者血浆外泌体miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-21-5p水平升高。将这三种外泌体miRNAs与临床变量结合后，受试者工作特征曲线下的面积从0.88上升到0.91[20]。类似的发现表明，非小细胞肺癌患者的外泌体miR-21和miR-4257水平明显高于健康对照组。作者还报道了非小细胞肺癌患者中血浆外泌体miR-21和miR-4257的表达水平与无病生存期显著相关。5个新发现的血浆外泌体miR-151a-5p、miR-10b-5p、miR-192-5p、miR-106b-3p和miR-484也显示了预后价值[21]。肺腺癌患者血浆中外泌体miR-484显著升高，术后显著降低[22]。另一个有趣的结果是，与使用免疫治疗的部分缓解患者相比，进展性疾病患者的外泌体has-miR-320d、has-miR-320c和has-miR-320b的表达量显著升高[23]。血清外泌体miRNAs谱也可能是监测治疗结果的有效生物标志物。在此背景下，与铂耐药的晚期非小细胞肺癌患者相比，铂敏感患者的miR-425-3p表达水平明显降低，但两组的外泌体miR-425-3p水平仍高于健康对照组。在顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中也发现了同样的现象。此外，作者还发现非小细胞肺癌患者的外泌体miR-425-3p水平越高，其无进展生存期越差[24]。血清外泌体miR-216b的检测能力优于CEA、CYFRA21-1和SCCA，血清外泌体miR-216b与CEA、CYFRA21-1和SCCA联合使用的受试者工作特征曲线下的面积值为0.84~0.925。此外，术后组miR-216b下调的患者(57.1%)发生了淋巴结转移[25]。三、外泌体lncRNAs作为肺癌的生物标志物在过去的几年里，已经广泛证明外泌体不仅包含miRNAs，而且还包含长链非编码RNA(lncRNAs)。越来越多的研究表明，外泌体可以在多种情况下稳定，在免疫应答、转移、耐药等方面发挥关键作用，这也为非小细胞肺癌的治疗提供了新的治疗靶点。到目前为止，也有研究专注于分析外泌体中的lncRNAs。它与健康志愿者相比，非小细胞肺癌患者的外泌体MALAT-1表达水平更高。此外，研究团队在体外实验中证实，在非小细胞肺癌细胞系中敲除MALAT-1后，抑制了肿瘤细胞的生长和增殖，促进了肿瘤细胞的凋亡[26]。同样，非小细胞肺癌患者外泌体lncRNA GAS5表达下调。此外，肿瘤体积较大、TNM分期较晚的非小细胞肺癌患者外泌体GAS5表达水平较低。外泌体GAS5的受试者工作特征曲线下的面积为0.857，当lncRNA与CEA结合时，受试者工作特征曲线下的面积增加到0.929。值得注意的是，外泌体GAS5可用于鉴别I期非小细胞肺癌患者，其受试者工作特征曲线下的面积为0.822[27]。肿瘤组织和非小细胞肺癌细胞系中外泌体DLX6-AS1的表达水平显著升高。此外，患者中DLX6-AS1的高表达与晚期非小细胞肺癌患者的疾病分期、淋巴结转移阳性、肿瘤分化差有关。作者报道外泌体DLX6-AS1的受试者工作特征曲线下的面积为0.806，敏感性为77.5%，特异性为85.9%[28]。非小细胞肺癌患者和早期小细胞肺癌患者血清外泌体lncRNA TBILA和AGAP2-AS1水平均高于健康对照组，并注意到术后这些外泌体lncRNAs水平下降。值得注意的是，这两种外泌体lncRNAs与CFRA21-1联合在非小细胞肺癌诊断中表现出了令人满意的诊断结果[29]。近期的一项研究发现，肺鳞癌患者血浆外泌体SOX2-OT水平显著升高。SOX2-OT诊断鳞状细胞癌的AUC值为0.815，灵敏度和特异性分别达到76%和73.17%，表明其具有有效诊断能力。此外，外泌体的SOX2-OT水平与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移密切相关。研究者还注意到肺鳞癌患者术后血浆外泌体SOX2-OT水平显著下降[30]。四、外泌体circRNAs作为肺癌的生物标志物近年来的研究表明，外泌体环状RNA可以用作癌症的诊断生物标志物。到目前为止，有3项研究集中于血浆外泌体中环状RNA的表达，其中2项是关于肺腺癌，另1项是关于肺鳞癌。在早期肺腺癌患者血浆外泌体中，has-circ-0001492、has-circ-0001346、has-circ-0000690、has-circ-0001439的表达水平较高，其中has-circ-0001492的表达水平最高。事实上，研究结果显示肺腺癌患者血浆中外泌体hsa-circRNA-0056616水平明显高于对照组。另外，在绘制血浆外泌体hsa-circRNA-0056616水平ROC曲线及对肺腺癌淋巴结转移的诊断价值时，得到曲线下面积为0.812，临界值为0.394，敏感性为0.792，特异性为0.810[31]。肺癌患者血浆外泌体中has-circ-0014235和has-circ-0025580表达增加。Has-circ-0014235和has-circ-0025580的AUC值分别为0.8254和0.8003[32]。五、展 望临床诊断采用有创检测往往会对肿癌患者造成伤害，因此，迫切需要开发无创、有效的检测方法。然而，miRNAs、lncRNAs和circRNAs在各种疾病中的作用需要准确定义，才能确定它们是否可以作为非侵入性生物标志物。例如，外泌体miR-21在肺癌、胃癌、肝癌和其他癌症中是不受调控的。这意味着它的紊乱不能单独与某一特定疾病相关，也不能作为一种特定的生物标志物。外泌体作为肺癌生物标志物的技术和生物学挑战包括生物样本的收集和存储、抗凝血剂的类型和样本的处理时间。与样本异质性相关的许多遗传、生理和环境因素都会影响外泌体的分析。我们需要注意的是，地理位置、民族特征和饮食习惯可能在不同程度上影响肺癌患者miRNAs、lncRNAs和circRNAs的表达。外泌体miRNAs和lncRNAs在肺部疾病中的作用取得了进展。然而，只有一小部分相关研究将这些发现应用于临床试验或临床治疗。目前外泌体的研究热点主要集中在潜在的生物标志物上，我们也在致力于探索外泌体在诊断和预后方面的潜力。我们相信，在不久的将来，不仅会看到外泌体在特定疾病中的应用，而且还会看到外泌体在靶向治疗中的发展。参考文献略
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