由于骨髓制片的特殊性，异常细胞可能出现在涂片的任意位置，全片数字化是基本要求，这样形态学专家才能浏览检查整个数字化玻片 FOCUS ON IVD CHINA◤骨髓涂片的自动化阅片流程需要遵守骨髓病理专家的工作思路01 全片搜索异常细胞：由于骨髓制片的特殊性，异常细胞可能出现在涂片的任意位置，全片数字化是基本要求，这样形态学专家才能浏览检查整个数字化玻片。通过训练相应的AI来辅助搜索：如巨核细胞计数、嗜血细胞计数、戈谢细胞计数或其他具有诊断价值的形态学异常。由于机器已将骨髓片全片数字化，可以使用弱监督全片特征提取训练对疾病的诊断方向给出提示［17］。文章中作者收集了236例MDS和87例MDS/MPN样本，使用骨髓活检细胞穿刺组织微阵列样本全片训练，模型可预测TET2基因突变(ROC=0.94)，spliceosome 突变（0.89）和7号染色体单体（0.89）。这些基因突变后引起形态学改变并被AI提取识别。• 骨髓细胞分类计数的报告位置的选取，通常由形态学老师根据样本状态来设定，也可以训练AI报告所有单层可阅区的细胞计数（报告数量可至百万个细胞，在MRD检测中使用）。• 200~100万个细胞报告数量，报告细胞数量越多，灵敏度越高，但审核的工作量也会越大。形态学专家可以根据样本的涂片状态、疾病类型做出选择。• 一个病人送检时通常为2张外周血涂片和2张骨髓涂片或其他特殊染色玻片，机器可全部数字化并存档，疑难病例可能需要审阅所有玻片后汇总形成综合性报告。机器需要具备病例管理与报告生成功能，与LIS系统互通。 Bionovation显微扫描仪的骨髓应用是按照以上思路设计的。由于血液病理样本量较大，报告有一定的即时性，扫描仪提供30片连续上样，单张玻片的扫描时间单相机配置时为3分钟内，双相机配置为2分钟。02 微生物检查： 抗酸染色结核杆菌检测：痰及其他样本涂片抗酸染色后检测结核杆菌是诊断结核病高效、经济的方法。市场上已经有成熟的样本制备与阅片机器，流程与人工阅片类似，100x油镜拍摄300个视野后软件识别出被染成红色的杆菌，形态学专家确认后签发报告。整个过程可实现自动化，缓解了实验室工作压力并降低了感染风险，检测结果的重复性与可靠性也得到了提升。 革兰氏染色微生物鉴定：原始样本，如：体液、分泌液，涂片后如果能发现病原体感染，是最快速、直接的诊断感染方法。革兰氏染色后，深度学习识别阳性与阴性细菌的结果准确性高。参考文献17、18中显示深度学习模型对革兰氏阳性簇状球菌、链状球菌和革兰氏阴性菌区分灵敏度与准确性分别为：98.4%和75.0%；93.2% 和97.2%；96.3% 和98.1%；检测质量已经超过人工阅片。参考文献20中提出了AI检测细菌感染的报告形式，同时强调有经验的形态学专家对报告审核的重要性（图18）。 Bionovation扫描仪细菌扫描：Bionovation扫描仪100X油镜扫描的图像质量可以区分出不同细菌的形态学特征，全片扫描时，2~3分钟内AI同步搜索20000个视野中的各类型细菌，扫描结束后结果即可呈现，最大可能地提高了检出的灵敏度。 图18 不同革兰氏阴阳性细菌标注数据特征提取后降维图与AI报告的方式 ［20］ 03 高倍镜多色荧光及全光谱扫描的实现： 使用荧光标记的探针或者荧光染料标记样本是检测样本抗原表达 （荧光抗体） 、基因表达 （FISH探针） 和细胞功能 （功能性荧光染料） 的基本方法并被广泛使用。临检实践中使用最多的是自身抗核抗体免疫荧光检测，FISH探针分析，以及目前逐渐发展起来的微生物荧光染色。 显微镜荧光数字成像的问题： 它与明场照明不同，荧光成像有淬灭问题，视野内激发光照射时间长后，荧光信号会衰减；数字荧光成像时，相机需要1ms以上的曝光时间才能看到荧光信号；这些问题使得荧光扫描难度增大：• 聚焦时间要短，否则荧光信号减弱，因此多为低倍镜扫描，20X物镜多见；• 成像时间长，每个视野都要停止曝光，无法像明场一样快速移动式扫描。 TDI相机荧光成像的优势： TDI相机全称为时间积分相机，设计用来拍摄快速移动物体。其特点是像素信号随移动物体一起移动并累加，信号累加的同时消除背景噪音，最后图像的整体信噪比提升。TDI相机拍摄荧光在生物领域已经成功应用，如测序仪内的荧光信号读取便是使用TDI相机。TDI相机可以显著缩短荧光扫描时间，增加成像的灵敏度。Bionovation使用60X APO NA 1.4油镜配合TDI相机，采样分辨率为0.1μm像素，可实现30mm/秒的扫描速度，成像荧光灵敏度在100MESF以内，全片以最高光学分辨率进行多色荧光扫描可在3~5分钟内完成。 全光谱成像的介绍与应用： TDI相机的成像单元小，一个26.5mm视场的显微镜物镜可容纳10条左右的TDI成像条带，即单个10条带TDI相机单次可成像10色荧光。使用滤光片分光将400~800nm波段截成四段后分别由四个相机按10nm波长带宽采集信号，最终形成400~800nm区间的10nm带宽的40色荧光光谱图像。不同荧光素之间的发射光谱叠加是荧光素使用不便之处，容易造成假阳性。由于每种荧光素都有独特的发射光谱，光谱成像后可拆分出每个荧光素的独立的发射光谱。光谱荧光检测技术目前广泛应用于流式细胞仪中，荧光素光谱叠加不再成为使用障碍。 04 荧光成像在检验科中的应用： FISH与MFISH原位快速检测： 细菌及各类病原体种类鉴定荧光原位杂交是使用直接/间接荧光标记的一定序列的寡核苷酸与样本中的互补序列进行配对，从而检测是否存在目标基因的方法。检测发生在样本原位，最大的优点是保留了样本环境信息，较容易区分出假阳性。通常检测的是样本中拷贝数足够多的基因，避免了PCR的复杂扩增操作。FISH杂交本身操作可实现自动化，可满足临床检验所需较大规模样本前处理。 鉴别样本中的病原体以给出感染诊断及用药指导一直是临检工作中的难点。金标准方法是细菌培训与鉴定，耗时长，准确度不高；近年发展起来的NGS技术为最理想的方法，可将样本中所有的可能病原体测出，但仪器较贵，检测成本高，并存在假阳性风险 （条件致病菌） ；蛋白质谱也是一个可行的方法，但依赖数据分析的准确性。另一个检测选项是使用针对微生物16s rRNA序列设计FISH探针，可以区分出各类型微生物及其亚型 （图19） ［21］ 。 图19 不同菌种的FISH探针序列及荧光标记 病原体通常包括细菌、病毒等，种类繁多，如果检测要覆盖所有可能的病原体，需要几十种探针。MFISH （多色FISH） 技术提供了这种检测多种病原体的可能。由于一种序列的FISH探针只能和一个目标结合，因此一个细菌只能被一种FISH探针杂交。虽然用于标记的FISH探针的荧光素种类有限，但通过排列组合 （不同颜色的荧光分子混合后发出不同的荧光，如红+绿最后形成黄色荧光） 可以得到2^n-1种颜色，n为荧光分子的数量，如果使用4种荧光素可得到15色探针，5荧光素可得31色。MFISH是理想的检测病原体的方法，它不仅可特异性检测出病原体，还可提供感染部位的信息，判断感染严重程度 ［22］ 。 图20 MFISH检测显示不同样本部位的不同细菌生长情况 ［22］ 微生物直接荧光染料检测 ：临检工作中通常使用革兰氏染色来搜索与鉴别细菌，由于样本中的细胞也同时被染色，细菌信号往往被淹没在背景中。细菌细胞与哺乳动物的细胞结构不同，故可以设计专门的荧光素染色细菌细胞的特殊成份与背景相区分。图21中列举可用于微生物染色的荧光染料。金胺“O”-罗丹明(B) （Auramine O Rhodamine B） 荧光染色检测结核杆菌的阳性率与阅片效率都明显高于明场染色 ［23］ 。 Calcofluor White M2R荧光增白剂，常用作真菌染色和细胞活力染色。该染料的用途广泛，可用于鉴定和研究几丁质的结构和生物合成。几丁质是自然界中发现第二丰富的多糖，来源于淡水海绵Spongilla lacustris。当与几丁质结合后，荧光增白剂的荧光得以加强，可用来阐述骨架结构中几丁质的特殊位置、对真菌细胞壁和白色念珠菌 （Candida albicans） 的生物膜进行染色。 图21 可用于细胞染色的常用荧光染料 ［23］ 图22 金胺“O”-罗丹明(B)染色结核杆菌，阳性信号呈黄色 ［23］ 循环肿瘤细胞检测与免疫荧光或FISH探针确认： CTC循环肿瘤细胞检测的特异性多数情况下是依靠荧光抗体标记实现，由于荧光抗体染色的特异性、可靠性存在争议，因此结果存在假阳性或漏检的可能。检测CTC基因突变或染色体异常的FISH探针有可能提供更高的检测特异性。 图23 CTC细胞分离后FISH探针确认 ［26］ 根据有文献报告使用4色FISH探针针对10q22.3/CEP10和3p22.1/3q29检测肺癌患者的CTC与活检相比，可达到94.2%准确率, 89% 灵敏度, 和100% 特异性 （图23） ［23］ 。针对不同的肿瘤筛查可以设计不同的FISH探针，以MFISH的形式实现15或35种探针检测，可显著提升液体活检肿瘤早筛的灵敏度与特异性。 细胞或组织免疫荧光分析: 细胞免疫荧光检测在自身抗体检测中已经应用多年，通过观察自身抗体结合细胞的位置与方式，对疾病进行诊断与分类。自身抗体与Hep-2细胞或肝片结合后，阳性部位的观察目前基本由人工判断。荧光样本数字化后可使用深度学习来分析，计算机分析的准确性为 95.07%, 灵敏度为 99.96%，特异性为 99.79% ，几乎达到了实验室检测的最好水平 ［2 7］ 。使用多色荧光抗体标记出样本中的浸润免疫细胞或其他类型细胞，可判断疾病的预后或指导用药。如PD-1抗体药物的使用需确认肿瘤或免疫细胞表达PD-1的水平。 05 实验室形态学专家标注数据、AI训练后应用的LDT（实验开发检测）模式。 形态学检查缺乏量化工具，对检测内容的描述大多是非数字方式，难以形成统一的标准。深度学习可以提取到训练数据的特征，并根据人为指定的分类数据，自动寻找分类界线。这些界线是高维度下的特征区别，多数是人类视觉无法感知的，或不在目前形态学诊断内容范围内的。大规模数据训练收敛后，深度学习可以较准确地复现标注精度，所以在工业中被普遍使用。但在医学领域，样本的多样性、分类的精确性、样本制备的可重复性这些因素导致了训练模型不太适合大规模使用。外周血细胞的深度学习分类是目前最有可能规模化使用的，原因如下：• 外周血细胞类型间差别较明显；• 样本制备可标准化； • 样本收集容易。 如果有一个标准数据集，在大部分形态学专家都认可其色彩方案、分类及训练网络结构的情况下，这个模型就可以被广泛使用。 如果待测样本的处理和数据采样全部与标准数据制备方式一致，其预期的准确率可以达到90%以上。实际情况是，标准数据集的形成难度较大。首先色彩难以统一，即使显示器显微镜数字图片颜色完成标准化，但人对颜色的感受是不同的，不同色彩方案下，专家的结论会有差异；其次如骨髓细胞分类，类别之间的界限是模糊的，不同专家有不同的倾向性。虽然非标准数据训练的AI模型较难广泛使用，但还是有很多办法达到适应性应用，如： • 开放数据，每个用户使用前需按照自己的习惯调整数据后进行个性化训练使用； • 对于分类不复杂的形态学检测，如细菌识别，可以统一机器的数字色彩方案及样本前处理方案； • 用户在实验室内收集数据后训练，模型只适用于本实验室内使用 （LDT） 。 ◤ 小结： 临床检验实验室中形态学检查的光学分辨率高，数字化难度大，数字化及自动分析落后于病理诊断领域。随着高速高分辨率显微扫描仪的普及，检验领域的形态学检查将更有可能实现全部自动化，因为检验科观察的对像以单个目标物为主：细胞或颗粒。相比组织样本，观察对象更适合机器学习。由于本文准备时间仓促，观点有失偏颇，错误之处恳请指正。【参考文献】[17]Machine Learning of Bone Marrow Histopathology Identifies Genetic and Clinical Determinants in Patients with MDS，May 2021 blood CANCER DISCOVERY | 239. 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（责任编辑：dawenwu）
张时民 | 显微镜数字化成像技术在临床检验医学中的应用
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